$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
1. צנטריפוגה הדרגתית
- הוסף 200 μL של תמיסת 50% יודיקסנול (טבלה 1) כדי לתת ריכוז סופי של 25% יודיקסנול. מערבבים היטב 10 פעמים עם פיפטה להגדיר על 300 מ"ל.
- הוסף 300 μL של תמיסת 29% יודיקסנול (טבלה 2) מתחת לתערובת 25%. השתמשו בקצה דק P1000 כדי למנוע ערבוב של השכבות.
- הוסף 300 μl של תמיסת 35% יודיקסנול (טבלה 3) מתחת לתערובת 29%. השתמשו בקצה דק P1000 כדי למנוע ערבוב של השכבות.
זהירות: שלב זה דורש הסרה הדרגתית של קצה פיפטה במהלך פיפטה כדי למנוע תזוזה מוגזמת של נפח.
- מניחים את הדגימות בצנטריפוגת דלי מתנדנדת, מסתובבים במשך 20 דקות במהירות של 3,500 x גרם ב-4 מעלות צלזיוס כשהבלם כבוי.
- הסר בעדינות את הדגימות מבלי לרעוד והתבונן תחת אור. רצועה לבנה שקופה של 95% גרעינים טהורים אמורה להיראות בין השכבה השנייה והשלישית (איור 1).
2. בידוד גרעינים
- שואפים את השכבות העליונות עד לפס הגרעינים הלבנים בשלב הביניים של 29%–35%.
- לאסוף את רצועת הגרעינים בנפח 200 מ"ל, להעביר לצינור חדש, ולסנן עם מסנן 20 מיקרומטר (רשימת חומרים).
הערה: אין צורך להשעות מחדש את הגרעינים לפני הסינון.
- בדוק תחת מיקרוסקופ אור כדי לוודא את הסרת פסולת גדולה ואת שלמות קרום הגרעין. גרעינים צריכים להיות עגולים, ואין לעוות את קרום הגרעין.
- ספירת גרעינים באמצעות צביעה כחולה טריפאן על המוציטומטר וגרעיני אליקוט עבור snRNA-seq/snATAC-seq.
טבלה 1: הכנת תערובת מאסטר יציבה של חיץ הומוגניזציה 6x
| 6x הומוגניזציה מאגר יציב מאסטר מיקס |
| מגיב | קונק סופי. | Vol for 100 (מ"ל) |
| 1 מטר CaCl₂ | 30 מ"מ | 3.0 |
| 1 מטר מ"ג(AC)₂ | 18 מ"מ | 1.8 |
| 1 מטר טריס pH 7.8 | 60 מ"מ | 6.0 |
| H₂O | | 89.2 |
| יש לשמור בטמפרטורת החדר, להימנע מחשיפה ישירה לאור |
טבלה 2: הכנת סוכרוז 1 מ '
| 1 מטר סוכרוז |
| 34.23 גרם של סוכרוז |
| מתמוססים ב-78.5 מ"ל מים |
| למלא עד 100 מ"ל עם מים |
טבלה 3: הכנת 6x תמיסה לא יציבה של חיץ הומוגניזציה (650 מיקרוליטר לדגימה)
| 6x תמיסה לא יציבה של מאגר הומוגניזציה (650 מ"ל לדגימה) |
| מגיב | קונק סופי. | Vol לכל מדגם (μL) |
| 6x הומוגניזציה מאגר יציב | פי 6 | 648.84 |
| 100 mM PMSF (פנילמתיל-סולפוניל פלואוריד) | 0.1 מ"מ | 1.08 |
| 14.3 מטר β-מרקפטואתנול | 1 מ"מ | 0.08 |
