כל הנהלים הנוגעים למודלים של בעלי חיים נבדקו על ידי הוועדה המוסדית המקומית לטיפול בבעלי חיים ועל ידי ועדת הבדיקה הווטרינרית JoVE.
1. קיבוע והכתמה של קטעי רקמת מוח שמורים בהקפאה
- כדי לשמור על שלמות ה-RNA, נקו את כל המכשירים לשימוש עם תמיסת ניקוי RNase. המשך עם פרוטוקול הקיבוע והצביעה בתוך מכסה אדים.
- הכן את פתרונות קיבוע המתואר נקי RNase חינם 50 מ"ל צינורות. הכינו את כל התמיסות עם מים נטולי RNase ביום הצביעה.
- באותו יום תבוצע מיקרודיסקציה בלייזר, להכין 100%, 95%, 70%, ו 50% אתנול תמיסות. שמור את התמיסות בצינורות סגורים היטב בטמפרטורת החדר.
- הכינו 4% Cresyl סגול ו 0.5% eosin Y בתמיסת אתנול 75%. מערבבים את התמיסה במרץ למשך דקה אחת ומסננים אותם דרך מסנן ניילון 0.45 מיקרומטר כדי להעלים עקבות של אבקה לא מומסת.
- הניחו את מגלשות הרקמה במיכל עם 95% אתנול למשך 30 שניות. העבירו שקופיות לצינור המכיל 75% אתנול; השאירו שם שקופיות למשך 30 שניות.
- מעבירים מגלשות לאתנול 50% ומשאירים אותן שם למשך 25 שניות. בשלב זה, ה-OCT יפוזר. מעבירים את השקופית לתמיסת 4% Cresyl סגול למשך 20 שניות ולאחר מכן מעבירים לתמיסת 0.5% eosin Y למשך 5 שניות.
- הוציאו את המגלשה מתמיסת הצבע וייבשו את המגלשה בעזרת נייר פילטר. לאחר מכן, הניחו את המגלשות באתנול 50% למשך 25 שניות. מעבירים את המגלשות לאתנול 75% למשך 25 שניות. מעבירים את המגלשות לאתנול 95% למשך 30 שניות. מעבירים את המגלשות לאתנול 100% למשך 60 שניות.
- שטפו את המגלשה עם קסילן. מעבירים אותם למיכל עם קסילן ומחכים 3 דקות.
- הכינו אמצעי הרכבה (למשל, מסטיק נקודתי) במים נטולי RNase. כדי להרכיב חלקי מוח של עכבר, דללו את מדיום ההרכבה במים נטולי RNase ביחס של 1:10.
- יבשו את המגלשות על משטח נטול RNase בטמפרטורת החדר למשך 10 שניות. לפני שהקסילן מתייבש, המשך להרכיב את השקופיות עם קטעי הרקמות.
- פזרו בעדינות את תמיסת ההרכבה על גבי הרקמה בשקופית בעזרת מברשת צבע דקה סטרילית ונטולת RNase. המתן 10-20 שניות ולאחר מכן העבר מיד את שקופיות הרקמה לפלטפורמת מיקרודיסקציה במיקרוסקופ.
הערה: היחס בין מים בינוניים לנטולי RNase המשמשים להרכבה משתנה בהתאם לרקמת העניין. יחס ההרכבה בינוני/מים משמר את המורפולוגיה של רקמת הגליומה עבור מיקרודיסקציה בלייזר מבלי להשפיע על שלמות הרנ"א.
