כל הנהלים הנוגעים למודלים של בעלי חיים נבדקו על ידי הוועדה המוסדית המקומית לטיפול בבעלי חיים ועל ידי ועדת הבדיקה הווטרינרית JoVE.
1. הכנת תרחיף חד-תאי מהמוח
- מדיום שיפוע צפיפות מדולל ביחס של 9:1 עם PBS בצינור חרוטי של 15 מ"ל כדי להפיק תמיסה סופית של 100%.
- מרדימים עכברים בשיא EAE עם הזרקה intraperitoneal של 1% נתרן pentobarbital (50 מ"ג / ק"ג) ו perfuse intracardially עם 20 מ"ל של PBS סטרילי קר כקרח. להשיג זאת על ידי הזרקה איטית ויציבה PBS לחדר השמאלי של הלב באמצעות מזרק 20 מ"ל ופתיחת אטריום ימין.
- חותכים את הגולגולת בזהירות מהאף לצוואר, ולאחר מכן להסיר את המוח מן תיבת הגולגולת לתוך 10 מ"ל של RPMI ב 50 מ"ל צינורות חרוטיים. מערבבים היטב כדי להסיר תאי דם אדומים דבקים. לאחר מכן, להסיר את המדיום על ידי שאיפה ולהוסיף 10 מ"ל של RPMI.
- מניחים את המוח והמדיום בצלחת 100 מ"מ. קוצצים דק עם סכין גילוח.
- מעבירים 6 מ"ל מהמנה להומוגנייזר זכוכית מסונטרת קר כקרח 7 מ"ל עם פיפטה נקייה. הימנע מהשארת כמויות גדולות של רקמות בפיפטה. כמות קטנה היא בלתי נמנעת.
- טוחנים את המוח באמצעות הבוכנה "הרופפת" של המזיק תחילה, ולאחר מכן משתמשים בבוכנה "הדוקה" עד שההשעיה הומוגנית ויוצקים לתוך צינור חרוטי מצונן של 15 מ"ל ושומרים על קרח.
- לאחר שכל הדגימות הומוגניות, להעריך את נפח. כוונן את עוצמת הקול עם RPMI ל 7 מ"ל. לאחר מכן, הניחו 3 מ"ל של מטריצת קרום מרתף קרה כקרח 100% בצינור צנטריפוגה חרוטי צונן של 15 מ"ל והוסיפו 7 מ"ל של הומוגנט במוח כדי להניב מדיום שיפוע צפיפות סופי של 30%. מערבבים לפי היפוך כמה פעמים. אין לערבל.
- כדי להבטיח ממשק חד, להוסיף בזהירות ובאיטיות 1 מ"ל של 70% צפיפות תחתית מדיום שיפוע בסל"ד עם פיפטה 3 מ"ל.
- צנטריפוגה ב 800 x גרם במשך 20 דקות בלבד ב 4 ° C. הגדר את התאוצה ל- 1 ואת ההאטה ל- 0. לאחר הצנטריפוגה, שאפו כמעט את כל השלב העליון, והקפידו להסיר לחלוטין את המיאלין בחלק העליון (איור 1).
- הסר את הממשק לתוך צינור 15 צנטריפוגות חדש. כוונן את עוצמת הקול ל -10 מ"ל עם סל"ד.
- צנטריפוגה ב 500 x גרם במשך 10 דקות. לאחר הצנטריפוגה, שאפו את הסופר-נטנט. השהה מחדש את הגלולה ב~200 μL של חיץ צביעת ציטומטריה של זרימה (FSC).
