מיצוי מבוסס אימונוזיקה של פפטידים יוביקוויטינילטים: טכניקה לחילוץ סלקטיבי של פפטידים מתויגים של יוביקוויטין משברי פפטידים מטוהרים

תקציר

מקור: Bezstarosti, K. et al. Detection of Protein Ubiquitination Sites by Peptide Enrichment and Mass Spectrometry. J. Vis. Exp. (2020)

סרטון זה מתאר שיטה לחלץ ולטהר פפטידים יוביקוויטיניל המכילים שאריות פפטידים די-גליצין מתערובת פפטידים מורכבת. השיטה המוצגת עשויה לסייע בזיהוי אתרי יוביקוויטינציה מקוריים בחלבון.

פרוטוקול

1. מיצוי פפטידים יוביקוויטיניל

1. השתמש בכרומטוגרפיה C18 בעלת pH גבוה בפאזה הפוכה (RP) עם חומר פאזות פולימרי נייח (300 Å, 50 מיקרומטר; ראה טבלת חומרים) המוטען למחסנית עמודה ריקה כדי לפרק את הפפטידים הטריפטיים. יש להתאים את גודל המיטה בשלב נייח לכמות עיכול החלבונים שיש להפריד. הכינו מחסנית עמודים ריקה של 6 מ"ל (ראו טבלת חומרים) מלאה ב-0.5 גרם של חומר פאזה נייח עבור ~10 מ"ג של עיכול חלבון. יחס עיכול החלבון לשלב נייח צריך להיות בערך 1:50 (w/w).
2. טען את הפפטידים על העמודה המוכנה ושטוף את העמודה עם כ- 10 נפחי עמודות של 0.1% TFA, ולאחר מכן כ- 10 נפחי עמודות של H2O.
3. הצמידו את הפפטידים לשלושה שברים עם 10 נפחי עמודות של תמיסת פורמט אמוניום 10 מילימטר (pH = 10) עם 7%, 13.5% ו-50% אצטוניטריל (AcN), בהתאמה. ליופיליזציה של כל השברים לשלמות.
4. השתמש בנוגדנים לשאריות יוביקוויטין (K-ε-GG) מצומדים לחרוזי אגרוז חלבון A להעשרה חיסונית של פפטידים diGly. מכיוון שהכמות המדויקת של נוגדנים לכל אצווה של חרוזים היא מידע קנייני ולא נחשף על ידי היצרן, מומלץ להשתמש באותה הגדרה עבור אצווה של חרוזים כמו היצרן עושה על מנת למנוע בלבול. שטפו אצווה אחת של חרוזים אלה 2x עם PBS ופצלו את תרחיף החרוזים לשישה שברים שווים. ראו איור 1 לתכנית ניסוי מפורטת.
5. ממיסים את שלושת שברי הפפטידים שנאספו בשלב 1.3 ב-1.4 מ"ל של חיץ המורכב מ-50 mM MOPS, 10 mM נתרן פוספט ו-50 mM NaCl (pH = 7.2), וסחררו את הפסולת.
6. הוסף את supernatants של השברים חרוזי נוגדן diGly ולדגור במשך 2 שעות ב 4 ° C על יחידה מסובבת. סובבו את החרוזים והעבירו את הסופרנאטנט לאצווה טרייה של חרוזי נוגדנים ודגרו שוב במשך שעתיים ב-4°C.
7. אחסנו את הסופרנאטנטים לניתוח פרוטאום גלובלי (GP) עוקב.
8. העבירו את החרוזים מכל שבר לקצה פיפטה של 200 מיקרוליטר המצויד בתקע מסנן GF/F כדי לשמור על החרוזים. הכנס את קצה פיפטה עם החרוזים לתוך צינור מיקרוצנטריפוגה 1.5 מ"ל מצויד מתאם קצה צנטריפוגה. שטפו את החרוזים 3x עם 200 μL של חיץ IAP קר כקרח ולאחר מכן 3x עם 200 μL של Milli-Q H₂O קר כקרח. סובבו את העמוד כלפי מטה במהירות של 200 x גרם במשך 2 דקות לפני כל שלב כביסה, אך היזהרו לא לתת לעמוד להתייבש. יש להקפיד על הפפטידים באמצעות 2 מחזורים של 50 μL של 0.15% TFA.
9. התפלו את הפפטידים באמצעות קצה שלב C18 (למעשה קצה פיפטה של 200 μL עם שני דיסקים C18) וייבשו אותם לשלמותם באמצעות צנטריפוגת ואקום.

תוצאות

איור 1: סקירה ניסויית.(א) סקירה כללית של הגישה הניסויית. הדגימות הוכנו, טריפסינזציה וחולקו לשלושה שברים באמצעות כרומטוגרפיה הפוכה עם pH גבוה. אצווה אחת של חרוזי נוגדנים פפטידים מסחריים α-diGly פוצלה לשישה שברים שווים ושלושת שברי הפפטיד הועמסו על שלושה משברי החרוזים. הפפטידים הדיגליים עברו טיהור חיסוני, פליטה ואספה, והזרימה הועברה לאחר מכן לשלושת שברי החרוזים הטריים הנותרים. הפפטידים הדיגליים שנאספו נותחו על ידי ספקטרומטריית מסות על ספקטרו...

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
Lysyl Endopeptidase (LysC)	Wako כימיקלים טהורים	129-02541
תנור NanoLC	עיצוב MPI, MS Wil GmbH
N-Lauroylsarcosine נתרן מלח	סיגמא-אולדריץ'	L-5125
Orbitrap Fusion Lumos mass ספקטרומטר	תרמופישר
PLRP-S (300 Å, 50 מיקרומטר) פולימרי חלקיקי פאזה הפוכים	אג'ילנט טכנולוגיות	PL1412-2K01
PTMScan Ubiquitin Remnant Motif (יא-ε-ג) ערכת	טכנולוגיות איתות תאי	5562
מחסנית Sep-Pak tC18 6 סמ"ק Vac	ווטרס	WAT036790	הסר את החומר tC18 מה מחסנית לפני מילוי המחסנית עם PLRP-S
נתרן דאוקסיכולאט	סיגמא-אולדריץ'	30970
בסיס טריס	סיגמא-אולדריץ'	T6066
Tris-HCl	סיגמא-אולדריץ'	T5941
טריפסין, מטופל ב-TPCK	תרמופישר	20233