בדיקת סינתזת DNA: טכניקה להערכת סינתזת DNA בתאים מתרבים באמצעות שילוב תימידין טריטיאט רדיואקטיבי

תקציר

מקור: Williams, M. et al. זיהוי מהיר של פנוטיפים נוירו-התפתחותיים בתאים עצביים מקדימים אנושיים (NPCs). J. Vis. Exp. (2018)

בסרטון זה, אנו קובעים את יכולת ההתרבות של תאי אב עצביים על ידי מדידת השילוב של נותב רדיואקטיבי tritiated thymidine לתוך הדנ"א של תאים. טכניקה זו יכולה לשמש לחקר התפשטות תאים לאחר טיפול בתרופות מסוימות וגורמי גדילה.

פרוטוקול

1. תחזוקה של NPCs

1. לוחות NPCs בצפיפות של 1.5 מיליון תאים לתוך באר מצופה ג'ל ECM מחקה המכילה 2 מ"ל של 100% מדיית הרחבה.
2. יש לדגור על NPCs בטמפרטורה של 37°C בסביבה לחה עם 5% CO₂.
3. הוסף 5 מיקרומטר של מעכב ROCK למדיה עבור NPCs ב-P3 ומטה, או עבור NPCs מופשר, כדי למנוע מוות תאי מוגזם. שנה מדיה לאחר 24 שעות כדי להסיר מעכב ROCK.
4. תאי מעבר כל 4-9 ימים, תלוי מתי הם הופכים לנפגשים. תאים נחשבים מתמזגים כאשר הם הופכים לשכבה מונו-שכבתית צפופה המכסה את כל החלק התחתון של משטח המנה.
5. לוחות NPCs בצפיפות של 1 עד 1.5 מיליון תאים לבאר אחת של צלחת 6 בארות. הסר מדיה משומשת כל 48 שעות והחלף ב- 2 מ"ל של מדיית הרחבה 100%.

3. בדיקת סינתזת DNA של תא מבשר עצבי

1. צלחת 100,000 תאים / באר בצלחת 24 בארות ולהעריך משולש / מצב.
2. הוסף רדיואקטיבי, טריטיאט [³H]-תימידין למדיום התרבית (1.5 μCi/mL) בכל באר לאחר 46 שעות בתרבית. לדגור על תאים ב 37 ° C במשך 2 h.
   הערה: בעת שימוש בחומרים רדיואקטיביים, קבל הדרכה מהמוסד שלך, עקוב אחר פרוטוקולי בטיחות רדיואקטיביים והשלך חומרים רדיואקטיביים לכלי קיבול הפסולת המיועדים לכך.
3. יש להסיר ולהיפטר כראוי ממדיה רדיואקטיבית לאחר שעתיים. להוסיף 300 μL של 0.25% טריפסין-EDTA שחומם מראש (0.5 mM) לכל באר ולדגור במשך 20 דקות ב 37°C.
4. הפעל את קוצר התאים (ראה סעיף חומרים) ואת המשאבה וודא שלחץ המשאבה נמוך מ- 200 PSI. הניחו נייר סינון דרך החלל בקוצר התא וקרעו את הפינה הימנית כדי לסמן כיוון נייר.
5. הניחו את צינורות האיסוף של קוצר התאים במגש ריק "ריק" ולחצו על Prewash כדי להרטיב את נייר הסינון. מניחים צינורות איסוף לתוך בארות דגימה ולרוץ (להתחיל).
6. לאחר שקוצר התאים סיים לאסוף דגימות, הרימו מהדק והקדמו נייר סינון כדי לחזור על הפעולה עבור כל ערכות הדגימות. יש לשטוף תמיד מראש בצלחת ריקה ו"ריקה".
7. יבש נייר סינון תחת מקור אור והגדר בקבוקונים מתאימים במגש. מנקבים את חפיסות הנייר לבקבוקונים ומוסיפים 2 מ"ל של קוקטייל נצנוץ נוזלי לכל בקבוקון. בקבוקוני מכסה ותווית.
8. יש לדגור על בקבוקונים בקוקטייל נצנוץ נוזלי למשך שעה לפחות לפני קריאת הספירה לדקה (CPM) במכונת נצנצים.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
DMEM/F12 בינוני מתקדם	תרמופישר סיינטיפיק	12634-010	רכיב של 100% התרחבות בינונית
מדיום נוירובזלי	תרמופישר סיינטיפיק	21103049
צלחות 24 בארות	תרמופישר סיינטיפיק	2021-05	לוחות פוליסטירן: משמשים לבדיקת סינתזת DNA NPC
למינין עכבר טבעי	Invitrogen	23017-015	מצע לציפוי לוחות: משמש לסינתזה של DNA NPC, הזנת שלב S ובדיקות מספר תא
פניצילין/סטרפטומיצין	תרמופישר סיינטיפיק	15140122	אנטיביוטיקה, רכיב במדיה הרחבה
2.5% טריפסין (10X)	גיבקו	15090-046	פתרון אנזימטי 10X
0.5 מטר EDTA	תרמופישר סיינטיפיק	AM9261	משמש בתמיסת טריפסין להרמת תאים לבדיקת סינתזת DNA
טריטיאט [3H]-תימידין	פרקיןאלמר	NET027E001	טריטיום רדיואקטיבי, תימידין
Fisherbrand 7 מ"ל HDPE בקבוקוני Scintillation	פישרברנד	03-337-1	בקבוקונים לספירת נצנצים נוזליים
EcoLite(+)	MP Biomedicals	188247501	קוקטייל נצנצים נוזלי
LS 6500 מונה נצנוץ נוזלי רב-תכליתי	בקמן קולטר	8043-30-1194	מונה נוזל Scintillation
קציר תאים אוטומטי למחצה של Skatron	התקנים מולקולריים & Skatron מכשירים, Inc.	סוג 11019	קוצר תאים חצי אוטומטי
נייר סינון GF/C כיתה, Whatman	GE Healthcare מדעי החיים	1822-849	נייר סינון סיבי זכוכית