NPC Neurosphere Assay: בדיקה חוץ גופית כדי להעריך את התגובה הנודדת של תאים מבשרי עצבים מן הנוירוספרה

תקציר

מקור: Williams, M. et al. Rapid Detection of Neurodevelopmental Phenotypes in Human Neural Precursor Cells (NPCs).J. Vis. Exp. (2018)

סרטון זה מדגים את מבחן ההגירה של תאי נוירוספירה עצביים מקדימים – בדיקה במבחנה לחקר התגובה הנודדת של תאים מקדימים עצביים מהנוירוספרה – באמצעות אנליזה מיקרוסקופית.

פרוטוקול

1. בדיקת הגירה נוירוספרית NPC

1. היווצרות נוירוספרה
   1. הוסיפו 1 מ"ל של מדיית הרחבה 100% לצלחת 35 מ"מ ללא מצע ציפוי. יש לדגור על כלים במשך 15 דקות לפחות בטמפרטורה של 37°C לפני ציפוי NPC. הכינו 2-3 מנות כדי להבטיח שיהיו מספיק נוירוספרות לבדיקת נדידת התא.
      הערה: היעדר מצע ציפוי מבטיח כי NPCs להישאר תלוי בתקשורת, אשר חיוני להיווצרות נוירוספרה. ציפוי כלים ימנע היווצרות נוירוספרה.
   2. הרמה, ניתוק ותאי כדור. גלולת תא השהיה מחדש ב-2-5 מ"ל של מדיית התפשטות 100% מחוממת מראש. צלחת 1 מיליון NPCs לתוך כל צלחת 35 מ"מ מוכן בסעיף 1.1.1.
   3. יש לדגור על NPCs בטמפרטורה של 37°C למשך 48 עד 96 שעות כדי לאפשר ל-NPCs להצטבר וליצור נוירוספרות. הערך את גודל הכדור באמצעות סרגל חי במיקרוסקופ עם ניגודיות פאזה. המתינו עד שרוב הכדורים יגיעו לקוטר משוער של 100 מיקרומטר (± 20 מיקרומטר) (איור 1). כדורים קטנים יותר יתפזרו לחלוטין ויתפרקו במהלך בדיקת הנדידה.
2. הכנת צלחות לבדיקת נדידת נוירוספרה
   1. יש להמיס אליציטוטים של ג'ל מחקה ECM ל-6 מ"ל של מדיית הרחבה של 30%. לאחר הכנת פתרון ECM-mimic gel/30% Expansion Media, הוסף כלי רכב, גורמי גדילה או תרופות מעניינות בריכוזים הרצויים.
      הערה: יש להגדיל את ריכוזי הרכב, התרופות וגורמי הגדילה כדי להסביר תוספת של 200 מיקרוליטר של נוירוספרות בסעיף 1.3.
   2. צלחת 1 מ"ל של ג'ל ECM-mimic / 30% פתרון מדיה הרחבה (± כלי רכב, גורמי גדילה או תרופות) לתוך באר אחת של צלחת 6 בארות. הכינו 2–3 בארות לכל תנאי ניסוי. לחלופין, ניתן להשתמש בכלים בקוטר 35 מ"מ. לדגור על צלחות לפחות 30 דקות ב 37 ° ^C.
      הערה: אין לשאוף את פתרון ECM-mimic gel/30% Expansion Media עבור בדיקה זו. ציפוי כדורים על גבי ג'ל ECM-Mimic שואף יוביל לנדידה מהירה ועודפת.
3. ציפוי נוירוספרות
   1. לאסוף נוירוספרות שנוצרו בסעיף 1.1 ולמקם אותם לתוך צינור חרוט. שטפו את הכלים בקוטר 35 מ"מ עם 1 מ"ל של 1x PBS כדי להבטיח שכל הנוירוספרות נאספות. סובב את הנוירוספרות שנאספו ב 100 x גרם במשך 5 דקות.
   2. להשהות מחדש את הנוירוספרות ב 1-3 מ"ל של 30% מדיה הרחבה שחוממה מראש. אם 1 צלחת של neurospheres נאסף, 1 מ"ל של התקשורת משמש כדי להשעות כדורים. אם נאספים 2 כלים, מתווספים 2 מ"ל של מדיה לכדורי השעיה וכו 'פיפטה בעדינות והשתמש רק ב- P-1000 כדי להבטיח שהכדורים לא יישברו.
   3. צלחת 200 μL של הנוירוספרות המרחפות לתוך ג'ל ECM-mimic / 30% תמיסת הרחבה שנעשתה בסעיף 1.2. לוחות סלע לכל הכיוונים כדי להפיץ נוירוספרות באופן שווה. לדגור על הצלחות במשך 48 שעות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס.
   4. הסר ג'ל מחקה ECM/תמיסת מדיה הרחבה 30% ותקן תאים ב- 4% PFA, שטוף ושמור תאים ב- 1x PBS + 0.05% נתרן Azide.
4. ניתוח נוירוספרות
   1. קבל תמונות של נוירוספרות שלמות באמצעות הגדרות ניגודיות פאזה ב- 10X. ודא שהכדורים אינם נוגעים זה בזה. מדוד העברה ממוצעת באמצעות תוכנת ImageJ.
   2. עקוב אחר קווי המתאר החיצוניים של הנוירוספירה באמצעות כלי הקו החופשי. ניתן לגשת לקו היד החופשית על ידי לחיצה ימנית על סמל הקו "ישר". עקוב באופן ידני באמצעות עכבר.
   3. השתמש בפונקציית המדידה כדי לחשב את שטח המעקב. ודא שהאפשרות "אזור" נבחרה כקריאה בחלון "הגדר מדידות" שנמצא תחת הכרטיסייה נתח. ראו איור 2 למעקב אחר קווי המתאר החיצוניים בכחול.
   4. עקוב אחר מסת התא הפנימית של הכדור ומדד שטח. ראו איור 2 לאיתור עקבות של קווי מתאר פנימיים באדום. כמת את הנדידה הממוצעת על-ידי הפחתת מסת התא הפנימית מכלל שטח הנוירוספרה.
   5. מדדו נוירוספרות שמציגות מסת תאים פנימית צפופה עם תאים שנודדים החוצה כשטיח רציף (איור 2).
   6. אין לכלול תאים מחוץ לשטיח או מנותקים מהנוירוספרה לצורך מדידה. ראו איור 2 דוגמאות לתאים (בעיגול לבן) שאינם נכללים במדידת השטיח החיצוני. לנתח מינימום של 20 נוירוספרות עבור כל מצב.

תוצאות

איור 1: בחירת נוירוספרות לבדיקת הגירה. (A) תמונת ניגודיות פאזה של שדה מייצג של נוירוספרות ב-24 שעות. כל הכדורים הם פחות מ -100 מיקרומטר ולכן אינם נאספים עבור בדיקת הנדידה. (B) תמונת ניגודיות פאזה של שדה מייצג של נוירוספרות ב-72 שעות. כל הכדורים נמצאים בטווח של 100 מיקרומטר ± 20 מיקרומטר, מה שמצביע על כך שהם מוכנים לאיסוף עבור בדיקת הנדידה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
מדיום נוירובזלי	תרמופישר סיינטיפיק	21103049	רכיב הן של NIM והן של 100% Expansion Medium
PSC Neural Induction Medium: קישור פרוטוקול: https://goo.gl/ euub7a	תרמופישר סיינטיפיק	A1647801	זוהי ערכה המורכבת ממדיום נוירובזלי (NB) ותוסף אינדוקציה עצבית פי 50 (ש"ח). השקל משמש לייצור 1X Neural Induction Medium ו-100% Expansion Medium
DMEM/F12 בינוני מתקדם	תרמופישר סיינטיפיק	12634-010	רכיב של 100% התרחבות בינונית
Matrigel מוסמך hESC	קורנינג	354277	ג'ל מטריצמימיק חוץ-תאי באישור hESC (ג'ל ECM-mimic)
צלחות 6 בארות	קורנינג	COR-3506	לוחות פוליסטירן המשמשים לתחזוקת NPC ולבדיקת הגירה נוירוספרית
אדם בסיסי FGF-2	פפרוטק	100-18 ב'	גורם גדילה
פניצילין/סטרפטומיצין	תרמופישר סיינטיפיק	15140122	אנטיביוטיקה, רכיב NIM, 100% הרחבה ו-30% הרחבה מדיה