בידוד אסטרוציטים: שיטה להשגת הכנה טהורה של אסטרוציטים קורטיקליים של עכבר

תקציר

מקור: Schildge, S. et al. בידוד ותרבות של אסטרוציטים בקליפת המוח של עכברים. J. Vis. Exp. (2013)

בסרטון זה אנו מתארים את השיטה להשגת הכנה טהורה של אסטרוציטים מעכברים שזה עתה נולדו.

פרוטוקול

כל הנהלים הנוגעים למודלים של בעלי חיים נבדקו על ידי הוועדה המוסדית המקומית לטיפול בבעלי חיים ועל ידי ועדת הבדיקה הווטרינרית JoVE.

1. בידוד וציפוי של תאים קורטיקליים מעורבים

בידוד תאי קליפת המוח מעורבים עבור תרביות אסטרוציטים יכול להתבצע באמצעות גורי עכברים P1 עד P4. על מנת להשיג צפיפות אסטרוציטים תקינה יש צורך להשתמש ב-4 קליפות עכבר לכל צלוחיות תרבית רקמה T75. לכן, אמצעי אחסון בפרוטוקול הבא מחושבים להכנת תא באמצעות 4 גורי עכבר.

1. לפני תחילת הליך הדיסקציה, יש לחמם מראש 30 מ"ל של תרבית אסטרוציטים (DMEM, גלוקוז גבוה + 10% סרום בקר עוברי מומת בחום + 1% פניצילין/סטרפטומיצין; ראה טבלה) עד 37°C. לצפות בקבוק T75 אחד עם 20 מ"ל של פולי-D-ליזין (PDL) בריכוז של 50 מיקרוגרם / מ"ל במים כיתה תרבית תאים במשך שעה אחת ב 37 ° C באינקובטור CO₂.
2. להליך הנתיחה, הכינו את כל הריאגנטים והחומרים הדרושים. תזדקק למספריים כירורגיים, מלקחיים עדינים חלקים, מלקחיים שטוחים, מגבות נייר, שקית אשפה, אתנול 70% ו -2 כלי ניתוח (קוטר 3.5 ס"מ) על קרח מלא 2 מ"ל HBSS כל אחד.
3. החזיקו וריססו בעדינות את ראשו וצווארו של גור העכבר באתנול 70%. החיה מוקרבת על ידי עריפת ראש באמצעות מספריים.
4. בצעו חתך בקו האמצע, אחורי עד קדמי, לאורך הקרקפת כדי לחשוף את הגולגולת.
5. חותכים את הגולגולת בזהירות מהצוואר לאף. שני חתכים נוספים מבוצעים כדי לאפשר גישה נוספת למוח: החתך הראשון נעשה קדמי של פקעות הריח, השני נחות של המוח הקטן כדי לנתק את הגולגולת מבסיס הגולגולת.
6. באמצעות המלקחיים השטוחים, דשי הגולגולת הופכים בעדינות הצידה והמוח מוציא ומכניס לצלחת הניתוח הראשונה המלאה ב- HBSS. מחזירים את התבשיל לקרח וממשיכים לקצור את כל 4 המוחות.
7. שאר הליך הדיסקציה מתבצע תחת סטריאומיקרוסקופ. ראשית, נורות הריח והמוח הקטן מוסרים באמצעות מלקחיים מנתחים עדינים (איור 1B).
8. על מנת לשלוף את קליפת המוח, תפסו את הקצה האחורי של המוח עם המלקחיים העדינים, בצעו חתך בקו האמצע בין ההמיספרות, הכניסו קבוצה שנייה של מלקחיים לחורשה שנוצרה וקילפו מהמוח את המבנה דמוי הצלחת של קליפת המוח.
9. נתחו בזהירות את קרומי המוח מהמיספרות קליפת המוח על-ידי משיכה עם המלקחיים העדינים (איור 1D). שלב זה מונע זיהום של תרבית האסטרוציטים הסופית על ידי תאי קרום המוח ופיברובלסטים. העבירו את חצאי קליפת המוח המוכנים לתוך המנה השנייה המלאה ב-HBSS והחזירו אותה לקרח. יש להמשיך בהתאם עם כל 4 קליפות המוח.
10. לבסוף, חתכו כל חצי כדור קליפת המוח לחתיכות קטנות באמצעות להבים חדים (בערך 4 עד 8 פעמים).
11. בתנאים סטריליים, העבירו חתיכות קליפת המוח לתוך צינור פלקון אחד של 50 מ"ל והוסיפו HBSS לנפח כולל של 22.5 מ"ל.
12. מוסיפים 2.5 מ"ל של 2.5% טריפסין, מערבבים ודגרים על הרקמה באמבט המים ב-37°C למשך 30 דקות. מערבבים על ידי ניעור מדי פעם כל 10 דקות.
13. צנטריפוגה במשך 5 דקות ב 300 x גרם כדי חתיכות רקמה קליפת המוח.
14. בזהירות להסיר supernatant על ידי decantation. על מנת להימנע מאיבוד גלולת הרקמה, ניתן לשמור אותה באופן מכני באמצעות פיפטה. נתקו את הרקמה לתרחיף של תא בודד על ידי הוספת 10 מ"ל ציפוי אסטרוציטים בינוני ופיפטינג נמרץ באמצעות פיפטה פלסטית של 10 מ"ל עד לניתוק חתיכות הרקמה לתאים בודדים (20 עד 30 פעמים). כוונן את עוצמת הקול ל -20 מ"ל באמצעות מדיום ציפוי אסטרוציטים. ניתן להוכיח את הדיסוציאציה של רקמת קליפת המוח לתאים בודדים באמצעות ספירה באמצעות המטוציטומטר. הכנה אחת של 4 קליפות עכבר אמורה להניב 10-15 x10⁶ תאים בודדים מנותקים.
15. שאפו PDL מבקבוק התרבית T75, צלחו את התרחיף החד-תאי המנותק ודגרו בטמפרטורה של 37°C באינקובטור_CO2.

2. השגת תרבית אסטרוציטים מועשרת

1. שנה את המדיום 2 ימים לאחר ציפוי של תאים קליפת המוח מעורבים וכל 3 ימים לאחר מכן.
2. לאחר 7 עד 8 ימים, כאשר אסטרוציטים נפגשים ותאי מיקרוגליה מונחים חשופים על שכבת האסטרוציטים או כבר מנותקים משכבת האסטרוציטים (איור 2), נערו את בקבוק T75 במהירות 180 סל"ד למשך 30 דקות על שייקר אורביטלי כדי להסיר מיקרוגליה. השליכו את הסופרנאטנט המכיל מיקרוגליה או אם אתם רוצים לגדל בתרבית ולבחון מיקרוגליה, סובבו אותו ושלחו צלחת לתרבית.
3. הוסף 20 מ"ל מדיום תרבית אסטרוציטים טריים והמשך על ידי ניעור הבקבוק במהירות 240 סל"ד למשך 6 שעות כדי להסיר תאים מקדימים אוליגודנדרוציטים (OPC). מכיוון שחלק מה-OPC לא יתנתקו לחלוטין משכבת האסטרוציטים, המשיכו ללחוץ במרץ ביד במשך דקה אחת על מנת למנוע זיהום OPC. השליכו את הסופרנאטנט או סובבו אותו וצלחת, אם תרצו לגדל OPC.
4. שטפו את שכבת האסטרוציטים הנותרת פעמיים עם PBS, שאפו את PBS, הוסיפו 5 מ"ל טריפסין-EDTA ודגרו באינקובטור CO₂ בטמפרטורה של 37°C. בדקו ניתוק אסטרוציטים כל 5 דקות ואכפו ניתוק אסטרוציטים על ידי פגיעה בבקבוק בכף היד (2-3 פעמים).
5. לאחר ניתוק האסטרוציטים מצלוחית התרבית, מוסיפים 5 מ"ל של תווך תרבית אסטרוציטים, מסובבים תאים ב 180 x גרם למשך 5 דקות, שואפים סופרנאטנט ומוסיפים 40 מ"ל מדיום ציפוי אסטרוציטים טריים. בקבוק תרבית רקמה T75 אחד אמור להניב בסביבות 1x10⁶ תאים לאחר פיצול התא הראשון. תאי צלחת בשתי צלוחיות תרבית T75 ודגרים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס באינקובטור CO₂. שנה את המדיום כל 2 עד 3 ימים.
6. 12-14 ימים לאחר הפיצול הראשון, אסטרוציטים מצופים בריכוז התא המתאים 24-48 שעות לפני ביצוע הניסוי. בקבוק תרבית רקמה T75 אחד אמור להניב סביב 1.5-2 x10⁶ תאים לאחר פיצול התא השני.

תוצאות

איור 1. דיסקציה של קליפת המוח של העכבר לאחר הלידה (P3). A) מוח שלם. B) המוח לאחר הסרת נורות הריח והמוח הקטן. C) בידוד קליפת המוח על-ידי קילוף המבנה דמוי הצלחת של קליפת המוח מהמוח. ד', ד') קליפת המוח מאתר הגחון והגבי עם קרומי המוח (חיצים שחורים מציינים עורקי קרום המוח). ה) קליפת המוח ללא קרומי המוח. סרגל קנה מידה, 1.5 מ"מ.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
מדיה של תרבית אסטרוציטים
DMEM גלוקוז גבוה	לייף טכנולוגיות	31966-021
FBS מנוטרל חום	לייף טכנולוגיות	10082-147	ריכוז סופי: 10%
פניצילין-סטרפטומיצין	לייף טכנולוגיות	15140-122	ריכוז סופי: 1%
פתרון לעיכול רקמת המוח
HBSS	לייף טכנולוגיות	14170-088
2.5% טריפסין	לייף טכנולוגיות	15090-046	ריכוז סופי: 0.25%
אחר
אתנול 70% (vol/vol)	רוט	9065.2
פולי-די-ליזין	מיליפור A-003	A-003-E
מים	הרשות הפלסטינית	S15-012	כיתה בתרבית תאים
PBS	הרשות הפלסטינית	H15-002	כיתה בתרבית תאים
0.05% טריפסין-EDTA	לייף טכנולוגיות	25300-062
0.45 מיקרומטר מסנן סטרילי	סרטוריוס	16555
צלחת פטרי בקוטר 3.5 ס"מ	BD בז	353001
15 מ"ל שפופרת פלקון	BD בז	352096
50 מ"ל שפופרת פלקון	BD בז	352070
75 סמ"ר בקבוק תרבית רקמה	BD בז	353136
מלקחיים בסדר	דומונט	2-1032; 2-1033	#3c; #5
קצה שטוח של מלקחיים	KLS מרטין	12-120-11
מספריים כירורגיים 13 ס"מ	אסקולאפ	BC-140-R
סטריאומיקרוסקופ	לייקה		MZ7.5
סטריאומיקרוסקופ + מצלמה	לייקה		MZ16F; DFC320
מיקרוסקופ + מצלמה	צייס; קנון		פרימו ורט; PowerShot A650 IS
צנטריפוגה	אפנדורף	5805000.017	צנטריפוגה5804R
שייקר אורביטלי	תרמו סיינטיפיק	ש"ק 4450-1CE	MaxQ 4450
אמבט מים	ג'ולאבו		SW20; 37 °C