תרבית תאי אנדותל מכלי דם זעירים במוח חולדה: הליך לבידוד ותרבית תאי אנדותל מכלי דם זעירים במוח חולדה

תקציר

מקור: Molino, Y. et al. Setting up an In Vitro Model of Rat Blood-Brain Barrier (BBB): A Focus on BBB Atlmeability and Receptor-mediated Transport. J. Vis. Exp.(2014)

סרטון זה מציג את הבידוד של כלי דם זעירים ממוח חולדה באמצעות שילוב של צנטריפוגה הדרגתית של צפיפות ומהוד עיכול אנזימטי. את כלי הדם המבודדים ניתן לגדל בתרבית בבקבוק תרבית המצופה מראש במטריצת קולגן ופיברונקטין כדי להשיג מושבות תאי אנדותל.

פרוטוקול

כל הנהלים הנוגעים למודלים של בעלי חיים נבדקו על ידי הוועדה המוסדית המקומית לטיפול בבעלי חיים ועל ידי ועדת הבדיקה הווטרינרית JoVE.

1. בידוד של כלי דם זעירים במוח חולדה

1. עבור כל תכשיר ועבור נסיין אחד, השתמשו ב-3 חולדות וויסטאר בנות חמישה שבועות.
2. ביום שני בשבוע הראשון, הכינו 2 צלוחיות T75 על ידי ציפוי קולגן מסוג IV ופיברונקטין שתיהן במינון 1 מיקרוגרם לסמ"ק² במי תרבית סטריליים (10 מ"ל ל-T75). אפשר לדבוק ב 37 ° C עד זריעה microtool.
3. בבוקר יום רביעי של השבוע הראשון, הרדימו את החולדות תחת שטף הולך וגובר של_CO2 כדי לגרום לנמנום, אובדן יציבה והפרעות נשימה, ולאחר מכן נקע צוואר הרחם. רססו את הראשים באתנול 70%. חותכים את הראשים עם זוג מספריים ומעבירים אותם לצלחת פטרי יבשה מתחת למכסה מנוע זרימה למינרית.
4. הוציאו את המוחות מהגולגולת ללא המוח הקטן ועצבי הראייה, ואז העבירו אותם לצלוחית פטרי מקוררת על קרח ומלאה בחיץ דיסקציה קר (HBSS בתוספת 1% BSA, פניצילין 100 יחידות למ"ל וסטרפטומיצין 100 מיקרוגרם/מ"ל).
5. חתכו את המוח לשניים כדי להפריד בין 2 ההמיספרות המוחיות ולהפריד בין המוח התיכון למוח הקדמי. מעבירים את המוח הקדמי לצלחת פטרי נקייה על קרח עם חיץ דיסקציה.
6. קח כמה חצאי כדור בצלחת פטרי חדשה עם חיץ דיסקציה קר כדי להסיר בזהירות את קרומי המוח מהמוח הקדמי תחת סטריאומיקרוסקופ עם מלקחיים מעוקלים N° 5. לאחר מכן, נקו את פנים המוח כדי להסיר את שמיכת המיאלין ולקבל קליפת קליפת המוח. צעדים אלה לא צריכים לקחת יותר מ 2 שעות לשימור רקמות והישרדות התא.
7. נתקו את קליפת המוח מ-3 מוחות ל-6 מ"ל של חיץ דיסקציה קר בהומוגנייזר מקפץ של 7 מ"ל ב-10 משיכות מעלה ומטה עם כל אחת מ-2 מזיקות של סילוקים שונים, 71 מיקרומטר ואחריו 20 מיקרומטר.
8. חלק את המתלה כדי לקבל את המקבילה של קליפת המוח 1 ב 1 מ"ל של צינור פלקון 50 מ"ל וצנטריפוגה ב 1,000 x גרם במשך 5 דקות ב RT. השליכו את הסופרנטנט.
9. עיכול התרחיף מקליפת מוח 1 עם 1 מ"ל של תמיסה אנזימטית המכילה תערובת של collagenases/dispase (60 מיקרוגרם/מ"ל-0.3 U/mL), DNase סוג I (35 מיקרוגרם/מ"ל-20K יחידות/מ"ל) וגנטמיצין (50 מיקרוגרם/מ"ל) בשייקר למשך 30 דקות ב-37°C.
10. ערבבו את תקציר 1 מ"ל מקליפת המוח 1 עם 10 מ"ל של 25% BSA/HBSS 1X והפרידו באמצעות צנטריפוגה תלוית צפיפות ב-3,600 x גרם למשך 15 דקות ב-RT. העבירו בזהירות את הדיסק העליון (מיאלין ופרנכימת מוח) ואת הסופרנאטנט לצינור פלקון נקי של 50 מ"ל וחזרו על הצנטריפוגה. שמור את הגלולה המתקבלת המכילה את microvessels המוח ב 4 ° C.
11. בזהירות להשליך את הדיסק העליון ואת supernatant. השהה מחדש את שני הכדוריות המתקבלות המכילות את כלי הדם במוח עם 1 מ"ל של HBSS קר 1X והעבר לצינור פלקון נקי של 50 מ"ל.
12. שטפו את כלי המיקרו על ידי תוספת של 20 מ"ל HBSS 1X קר וצנטריפוגה ב 1,000 x גרם למשך 5 דקות. השליכו את הסופרנטנט.
13. יתר על כן, לעכל את microvessels מ 1 קליפת המוח עם 1 מ"ל של אותה תמיסה אנזימטית כמתואר בשלב 1.9 במהלך 1 שעה ב 37 ° C בשייקר.
14. לאחר מכן, ערבבו את כלי הדם המעוכלים מכל אחד משלושת קליפות המוח לצינור אחד ונפרדו עוד יותר לשני צינורות פלקון של 50 מ"ל כדי לקבל מיקרו-כלים שהופקו מקליפת המוח המקבילה של קליפת מוח וחצי (1.5) לכל צינור. הוסף 30 מ"ל של חיץ דיסקציה קרה וצנטריפוגה ב- 1,000 x גרם למשך 5 דקות ב- RT.
15. יש להשהות מחדש את כדורית כלי הדם הזעירים ב-10 מ"ל DMEM/F12 בתוספת סרום 20% דל טסיות בקר שמקורו בפלסמה, גורם גדילה פיברובלסטים בסיסי (bFGF, 2 ננוגרם/מ"ל), הפרין (100 מיקרוגרם/מ"ל), גנטמיצין (50 מיקרוגרם/מ"ל) ו-HEPES (2.5 מילימול), הנקראים מדיה של תאי אנדותל (ECM) בתוספת פורומיצין ב-4 מיקרוגרם/מ"ל.
16. קחו את 2 צלוחיות T75 מצופות מהאינקובטור, שאפו את עודפי הציפוי, ופלטו את המיקרו-כלים מכל צינור בבקבוק T75 אחד (מיקרו-כלים שחולצו מקליפת המוח 1.5 לכל צלוחיות T75).

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
סרום בקר עוברי	Invitrogen	10270-098	-20 °C / 1 שנה
חלק BSA V אנדוטוקסין נמוך	הרשות הפלסטינית	K45-011-500 גרם	4 °C
פניצילין-סטרפטומיצין	Invitrogen	15140-122	-20 °C
T75 צלוחיות	בקטון דיקינסון פלקון	353135
חיץ HEPES (1 מטר)	Invitrogen	15630-056	4 °C / 1 שנה
קולגן סוג IV עכבר (10 x 1 מ"ג)	בקטון דיקינסון	356233	-20 °C / חודש אחד
פיברונקטין הומיין פלזמה (5 מ"ג)	בקטון דיקינסון	356008	-20 °C / חודש אחד
מספריים קפיציים Vannas, ישר (9 ס"מ)	כלים מדעיים משובחים	91500-09
מספריים ישרים (9 ס"מ)	כלים מדעיים משובחים	14568-09
מלקחיים Dumont #5/45 (11 ס"מ)	כלים מדעיים משובחים	11251-35
מלקחיים Graefe, רוחב קצה 0.8 מ"מ	כלים מדעיים משובחים	11050-10
מלקחיים Graefe, רוחב קצה העקומה 0.8 מ"מ	כלים מדעיים משובחים	11051-10
תערובת קולגנאזות / דיספאס (2 x 5 מ"ג)	רוש דיאגנוסטיקה	05 401 054 001	-20 °C / 3 חודשים
DNase I (100 מ"ג / 569 KU / מ"ג)	סיגמא אולדריץ'	DN25-100 מ"ג	-20 °C / 1 שנה
גנטמיצין (10 מ"ג/מ"ל)	Invitrogen	15710-049	4 °C / 1 שנה
DMEM/F12	Invitrogen	31331-028	4 °C
סרום בקר מפלזמה ירודה טסיות (500 מ"ל)	Clinisciences	BT-214-100	-20 °C / 1 שנה
bFGF (10 מיקרוגרם)	Invitrogen	13256-029	-20 °C / 6 חודשים
מלח הפרין Na מרירית חזיר דרגה I	סיגמא אולדריץ'	H3149-100KU	4 °C / 1 שנה
פורומיצין	סיגמא אולדריץ'	P8,833-10 מ"ג	-20 °C / 6 חודשים