מחסום גידול דם-מוח או מודל BBTB: התאמה של מחסום הדם-מוח או מודל BBB להערכת מתן טיפולים לגידול

תקציר

מקור: Le Joncour, V. et al. Predicting In Vivo Payloads Delivery באמצעות מחסום גידולי דם-מוח בצלחת. J. Vis. Exp. (2019)

בסרטון זה, אנו מתארים פרוטוקול מקיף לביסוס מודל במבחנה המחקה את מחסום הגידול בדם-מוח. המודל טומן בחובו הבטחה להבין את אספקת החומרים הטיפוליים לטיפול בגידולי מוח.

פרוטוקול

כל הנהלים הנוגעים למודלים של בעלי חיים נבדקו על ידי הוועדה המוסדית המקומית לטיפול בבעלי חיים ועל ידי ועדת הבדיקה הווטרינרית JoVE.

1. הקמת חיקויי BBTB

הערה: מדיום תרבית תאים ותוספי מזון מפורטים בטבלת החומרים.

1. הכנת אסטרוציטים
   הערה: הכרכים הבאים מתאימים לצלוחית פטרי בקוטר 10 ס"מ או לצלוחית תרבית תאים T75.
   1. מתחת למכסה מנוע של תרבית תאים סטרילית, שטפו בזהירות את האסטרוציטים בתרבית עם 5 מ"ל של מלח סטרילי חוצץ פוספט (PBS). השליכו בעדינות את PBS באמצעות משאבת ואקום והוסיפו 2 מ"ל של מגיב הדיסוציאציה התאית למשך 5 דקות (בטמפרטורה של 37°C, ראו טבלת החומרים) כדי לנתק את התאים. בדוק את ניתוק התא מתחת למיקרוסקופ. אין לחרוג מ-5 דקות דגירה כדי להגביל את הלחץ על התאים.
   2. הוסף 10 מ"ל של תווך תרבית תאי אסטרוציטים שלם סטרילי (ABM+) לכלי הדם כדי לעכב את הפעילות של מגיב הדיסוציאציה התאית. השתמש פיפטה סרולוגית סטרילית כדי להעביר את התאים מנותקים מכלי הדם לצינור סטרילי 15 מ"ל. צנטריפוגה את מתלה התא למשך 3 דקות במהירות 250 rcf (תאוצה: 9 rcf/s, האטה: 5 rcf/s) בטמפרטורת החדר (RT).
   3. בינתיים, הכינו את התוספות (ראו טבלת חומרים): בעזרת מלקחיים סטריליים, הניחו את התוספות כשצד המוח כלפי מעלה (איור 1A) על מכסה של צלחת סטרילית בעלת 6 בארות (איור 1B). ודא מראש שניתן להניח את הצלחת הפוכה על התוספות מבלי לגעת או להזיז את התוספות במהלך התהליך.
      הערה: מיקום נכון של התוספות מאפשר לכידה של מתלה האסטרוציטים בין הממברנה לתחתית הבאר.
   4. לאחר הצנטריפוגה, יש להשליך בזהירות את הסופרנאטנט ממתלה התא; להשהות מחדש את גלולת האסטרוציטים ב-1 מ"ל של ABM+ על ידי השעיה עדינה של הגלולה על דופן הצינור עד פי 5. הימנע pipetting מוגזם של התאים כדי להגביל את הלחץ על התאים. ספור את התאים והתאם את צפיפות השעיית התא ל- 1.5 x 10⁵ תאים ב- 400 μL של ABM+/insert.
   5. הניחו את תרחיף התא במרכז צד המוח של קרום החדרה (איור 1B), ופזרו אותו בזהירות רבה על-ידי שימוש בכוח נימי עם קצה פיפטה סטרילי. הימנע ממגע ישיר מכיוון שהקרום שביר במיוחד.
   6. כאשר צד המוח של התוספות עדיין למעלה, הניחו את צלחת 6 הבארות בחזרה על התוספות. זה מבטיח שתרחיף התא יהיה כלוא בין הממברנה לתחתית הבאר בפועל (איור 1C). הימנע מבועות אוויר בהשעיית התא, מכיוון שהוא ימנע את ההתפשטות ההומוגנית של האסטרוציטים על הממברנה.
   7. הניחו את הצלחת והתוספות, כשצד המוח כלפי מעלה, באינקובטור (בטמפרטורה של 37°C עם 5% CO₂) כדי לאפשר את היצמדות התא למשך שעתיים לפחות (אסטרוציטים בני אלמוות) ועד 6 שעות (אסטרוציטים ראשוניים אנושיים).
      הערה: מכיוון שהתוספות נשמרות הפוכות, הדמיה של הידבקות התא אינה אפשרית תחת מיקרוסקופ. לכן, מומלץ לזרוע כלי תרבית תאים רגיל נפרד ולשלוט בהידבקות התא בכלי לאורך זמן. מניפולציה זהירה של הממברנה היא חובה מכיוון שהתוצאות יהיו לא אמינות כאשר הממברנות ניזוקו.
   8. בתום זמן הדגירה, יש לוודא שאין דליפות תרחיף תאים מחוץ לאזור הזריעה ולהשליך את התוספות אם הן דולפות. החזירו את צלחת 6 הקידוחים למקומה הרגיל, בעזרת תוספות שכעת יגרמו לצד הדם כלפי מעלה (איור 1A). הוסף 2.6 מ"ל של ABM+ לכל באר. יוצקים 2.5 מ"ל של מדיום אסטרוציטים שלם לתוך כל תוספת ומניחים את הצלחת באינקובטור (ב 37 ° C עם 5% CO₂).

2. הכנת תאי אנדותל

הערה: עבור תאי אנדותל מיקרו-וסקולריים במוח (bEND3), התאים חייבים להגיע למפגש של 100% כדי להבטיח מגע מרבי בין תאים לתאים המעוררים את ביטוי החלבון האופטימלי בצומת הדוק ביום הניסוי. זה לא חל על תאי אנדותל של וריד הטבור האנושי (HuAR2T) מכיוון שנוכחות אסטרוציטים נדרשת לביטוי חלבון צומת הדוק עבור תאים אלה.

1. המשך כפי שתואר קודם לכן עבור האסטרוציטים לדיסוציאציה של תאים. לאחר צנטריפוגה, בזהירות להשליך את supernatant; יש להשהות מחדש את כדורית תא האנדותל ב-1 מ"ל של מדיום תרבית תאי אנדותל מלאה (EBM+) על ידי השעיה איטית של תרחיף התא על דופן הצינור עד פי 5. הימנע pipetting מוגזם של התאים כדי להגביל את הלחץ על התאים. ספרו את התאים והתאימו את צפיפות תרחיף התא ל 2 x 10⁵ תאים ב 2.5 מ"ל / החדרה של תרבית תאי אנדותל מדיום ללא סרום (EBM-) וגורם גדילה אנדותל כלי דם-A (VEGF-A).
2. מוציאים את הצלחת המכילה את התוספות, משליכים בזהירות את המדיום מצד הדם, ומחליפים אותו ב -2.5 מ"ל של השעיית תאי האנדותל. החזירו את הצלחת לאינקובטור (בטמפרטורה של 37°C עם 5% CO₂) והשאירו אותה למשך הלילה לתאי האנדותל להיצמד לקרום.
3. למחרת, הכינו צלחת סטרילית בת 6 בארות על ידי העברת 3 מ"ל של מדיום אסטרוציטים ללא סרום שחומם מראש (ABM-) לכל באר. על ידי טיפול בתוספות עם מלקחיים סטריליים, יש להשליך בזהירות את התווך המלא של האנדותל מצד הדם, להניח את העלון בצלחת החדשה המכילה ABM-, ולהוסיף 2.5 מ"ל של EBM-.
   הערה: השימוש ב- EBM - הוא קריטי לביסוס מחסום האנדותל.
4. השאירו את התוספות באינקובטור (בטמפרטורה של 37°C עם 5% CO₂) עם הפרעה פיזית מינימלית ושינויי טמפרטורה למשך 5 ימים, מה שמאפשר ייצור של קרום מרתף האנדותל, מגעים של אסטרוציטים עם תאי אנדותל, ובסופו של דבר, היווצרות חיקוי BBTB. החלף את המדיום ביום ההעברה על תרביות תאי גליומה.

3. הכנת תאי גליומה

הערה: למרות שכדורי גליובלסטומה שמקורם במטופל משמשים כאן, ניתן להתאים בקלות את הפרוטוקול הבא לתאי גליובלסטומה דבקים וזמינים מסחרית כגון U-87MG.

1. לחלופין, להדמיית אימונופלואורסצנטיות, יש להניח עד ארבע כיסויי בורוסיליקט סטריליים עגולים (ø 0.9 ס"מ) לכל באר בצלחת בת 6 בארות המכילה 2 מ"ל פולי-D-ליזין (0.01%). יש לדגור בטמפרטורת החדר למשך 30 דקות.
2. בינתיים, בזהירות להעביר את כדורי הגידול מכלי תרבית התא לצינור סטרילי 15 מ"ל באמצעות פיפטה סרולוגית סטרילית. צנטריפוגה את כדורי הגידול במשך 3 דקות ב 250 rcf.
3. השליכו את הסופרנטנט, השהו מחדש בעדינות את הכדורים ב-1 מ"ל של תווך תאי גליומה נטול bFGF/EGF (GBM-) וספרו את התאים. התאם את צפיפות התאים לכ- 10,⁴ כדורים/מ"ל (10,⁵ תאים/מ"ל) ב- GBM-.
4. השליכו את הפולי-D-ליזין מהבארות ושטפו אותן 3x עם PBS סטרילי. זרעו את הצלחת עם 3 מ"ל / באר של תרחיף הספרואיד של הגידול והעבירו את התוספות עם חיקוי BBB על תרחיף תאי הגידול.
5. יש לדגור למשך הלילה (בטמפרטורה של 37°C עם 5% CO₂) כדי לאפשר שיווי משקל בין הדם לבין צדי הגידול במוח של הבדיקה. למחרת, להחליף את המדיה בצד הדם עם EBM- בתוספת מולקולות/תרופות/ננו-חלקיקים מעניינים. הדגימות נאספות לאורך זמן לצורך כימות ישיר כמתואר בסעיף הקודם. התאים קבועים בנקודת זמן מדויקת להדמיית פלואורסצנטיות.

תוצאות

איור 1: תיאור של מודל מחסום גידול הדם-מוח (BBTB).(A) ייצוג סכמטי של המיקומים של סוגי תאים שונים. (B) איור של מיקום התוספת על מכסה לוח 6 הקידוחים וטכניקת הזריעה של האסטרוציטים בצד המוח של קרום האינווסט. (C) איור של מיקום לוח 6 בארות המאפשר הידבקות אסטרוציטים. (D) מיקרוגרפים אימונופלואורסצנטיים של חלבוני הצומת ההדוק zonula occludens-1 (ZO-1, שורה עליונה, אדום) וקלודין-5 (שו...

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
תאים
בנד3	ATCC	CRL-2299	תרבית בתרבית: DMEM (1 גרם / ליטר גלוקוז) בתוספת 10% FBS- 5 מ"ל L-גלוטמין ו 5 מ"ל פניצילין/סטרפטומיצין
אסטרוציטים של עכברים מונצחים של HIFko	מבודד במעבדת ד"ר גבריאלה ברגרס	https://doi.org/10.1016/ S1535-6108(03)00194-6	בתרבית: BME-1 בתוספת FBS 5% - 5 מ"ל 1 M HEPES-5 מ"ל 100 mM נתרן פירובט- 3 גרם D-גלוקוז ו- 5 מ"ל פניצילין/ סטרפטומיצין
HuAR2T	מבודד במעבדת ד"ר דאגמר וירת'	https://doi.org/10.1089/ten.tea.2009.0184	תרבית בתרבית: EBM-2 עם SupplementMix אסטרוציטים ראשוניים אנושיים רגילים Lonza CC-2565 בתרבית בתרבית: ABM עם SingleQuots
חומרים וריאגנטים
100 מ"מ x17 מ"מ מנה נונקלון דלתא	תרמופישר סיינטיפיק	150350
10 מ"ל צינור סרולוגי	תרמופישר סיינטיפיק	170361
15 מ"ל צינורות צנטריפוגות פוליפרופילן סטריליות חרוטיות	תרמופישר סיינטיפיק	339650
ABM בינוני בסיסי 500 מ"ל	לונזה	CC-3187	עבור אסטרוציטים אנושיים ראשוניים. ABM+: מכיל את כל התוספים מתערובת התוספים. ABM-: כל התוספים למעט rhEGF ו- FBS
פתרון ניתוק תאי Accutase	קורנינג	25-058-CI
תוספי AGM SingleQuots וגורמי גדילה	לונזה	CC-4123
תוסף B27	גיבקו	17504-044	הן עבור GBM + והן עבור - בינוני
עיט בינוני בזאלי	תרמופישר סיינטיפיק	21010046	BME-1
קורנינג קוסטאר TC מטופל 6 צלחות באר	סיגמא-אולדריץ'	CLS3506
תוספות תרבית תאים קורנינג טרנסוול פוליאסטר תרבית תאים	סיגמא-אולדריץ'	CLS3452
D-גלוקוז	סיגמא-אולדריץ'	G8270	יש להמיס ב-50 מ"ל של BME-1 ומסנן סטרילי לפני הוספה למדיום
F-12 Ham בינוני/מזין של Dulbecco	גיבקו	21331-020	ספציפית לתרבית של הכדורים שמקורם במטופל שבודדו במעבדה שלנו; עשוי להשתנות עבור קווי תאי גליומה אחרים
EBM-2 צמיחה בינונית SupplementMix	PromoCell	C-39216	EBM+: מכיל את כל התוספים מתמהיל התוספים. EBM-: כל התוספים למעט VEGF-A ו- FBS
מדיום בסיסי אנדותל 2 (EBM-2)	PromoCell	C-22211	EBM+: מכיל את כל התוספים מתמהיל התוספים. EBM-: כל התוספים למעט VEGF-A ו- FBS
סרום בקר עוברי (FBS), מוסמך, מנוטרל חום, מאושר על ידי האיחוד האירופי מוצא דרום אמריקה	תרמופישר סיינטיפיק	10500056
מלח נתרן פלואורסצאין	סיגמא-אולדריץ'	F6377
גריינר סלסטאר 96 צלחות באר	סיגמא-אולדריץ'	גריינר 655090	בארות פוליסטירן שחורות תחתית שטוחה (עם תחתית מיקרו שקופה)
Menzel-Gläser כיסוי בורוסיליקט עגול 0.9 ס"מ מחליקים	תרמו סיינטיפיק	10313573
טבליות PBS	מדיקגו	09-9400-100	טבליה אחת לליטר dH2O; ולאחר מכן לעקר את הפתרון על ידי autoclaving
פולי-D-ליזין הידרוברומיד	סיגמא-אולדריץ'	P6407
EGF אנושי רקומביננטי	פפרוטק	GMP100-15	עבור GBM+ בינוני
רקומביננטי אנושי FGF-בסיסי (154 a.a.)	פפרוטק	100-18 ב'	עבור GBM+ בינוני