מחסום דם-מוח מחקה בדיקת חדירות: בדיקת מבחנה להערכת החדירות של חיקוי BBB למולקולות עוקבות

תקציר

מקור: Le Joncour, V. et al. Predicting In Vivo Payloads Delivery באמצעות מחסום גידול-דם במוח בצלחת. J. Vis. Exp. (2019)

סרטון זה מתאר בדיקת חדירות להערכת החדירות של מחסום דם-מוח במבחנה באמצעות מולקולות נתרן פלואורסצאין.

פרוטוקול

1. Measurement of the BBTB Mimic Permeability
   

   1. דיפוזיה פסיבית של הצבע הפלואורסצנטי נתרן-פלואורסצאין במשקל מולקולרי קטן (Na-Fl) לאורך זמן מהדם לצד המוח של התוספות מאפשרת חישוב ערכי החדירות לפי הנוסחה הבאה:
      כאן, dFwell הוא ערך הפלואורסצנטיות הנמדד בבאר בנקודת זמן מסוימת פחות הערך האוטופלואורסצנטי הבינוני של תרבית התא, dT הוא הזמן בשניות, A הוא פני השטח של המחסום בסנטימטרים רבועים, ו- dFinsert הוא ערך הפלואורסצנטיות הנמדד בהוספה באותה נקודת זמן פחות הערך האוטופלואורסצנטי הבינוני).
   2. אספו 100 μL של התווך הן מהדם והן מהצד המוחי של חיקוי BBTB והעבירו כל אחד מהם לצלחת נפרדת בעלת תחתית שטוחה ושחורה של 96 בארות למדידות פלואורסצנטיות עוקבות. השתמש במדיה הרגילה כמדיה ריקה כדי לתקן את הפלואורסצנטיות האוטומטית.
   3. להכין 2.5 מ"ל לכל באר של Na-Fl (50 μM) ב EBM-. חממו מראש את תמיסת Na-Fl ל-37°C. החליפו את המדיה מצד הדם של התוספות במדיה המכילה Na-Fl. הפעל טיימר ברגע שהמדיום יוחלף.
   4. אספו בזהירות 100 מיקרוליטר של מדיה הן מהדם והן מהצד המוחי של התוספות ב-5, 30, 60 ו-120 דקות. העבירו כל דגימה לבארות נפרדות של הצלחת השחורה בת 96 הבארות.
   5. בהתאם לכך, החלף את המדיה שנאספה מהתוספות כדי לשמור על איזון עוצמת הקול בין שני הצדדים. החזירו את התוספות לאינקובטור בין כל אוסף דגימות כדי למזער את שינויי הטמפרטורה.
   6. כמת את הפלואורסצנטיות מהדגימות שנאספו, באמצעות קורא לוחות כאשר המסנן מוגדר על 480/560 ננומטר (עירור ופליטה, בהתאמה).
      הערה: פלואורסצנטיות מצד המוח כמעט בלתי ניתנת לגילוי בנקודת הזמן של 5 דקות. ערכים גבוהים בהשוואה לריק מצביעים על דליפה/נזק לקרום האינסרט או למחסום; לכן, אל תכלול אותם מניתוחים נוספים. ערכי החדירות הצפויים של Na-Fl עבור BBTB צריכים להיות בטווח של 10-5 עד 10-6 ס"מ לשנייה (טבלה 1).

טבלה 1: ערכי החדירות של נתרן-פלואורסצאין (Na-Fl) (בסנטימטרים לשנייה) נקבעו במבחנה במערכות התרביות המשותפת שצוינו ו-in vivo בעכברים עירומים מסוג NMRI. נתונים מניסוי מייצג (n = 3 עכברים).

חיקוי BBTB של Murine	בנד3	כ bEND3+HIFko	bEND3+GB	bEND3+HIFko As+GB	In vivo
חדירות (10–6 ס"מ לשנייה)	27.63	6.74	26.8	10.83	5.57
SD (10–6 ס"מ לשנייה)	3.45	3.01	7.99	2.65	2.19
חיקוי BBTB אנושי	HuAR2T	HuAR2T+hIAs	HuAR2T+GB	HuAR2T+hIAs+GB
חדירות (10–6 ס"מ לשנייה)	104.92	47.4	89.08	48.24
SD (10–6 ס"מ לשנייה)	27.1	14.32	10.21	13.07

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
חומר מגיב
10 מ"ל צינור סרולוגי	תרמופישר סיינטיפיק	170361
ABM בסיסי בינוני, 500 מ"ל	לונזה	CC-3187	עבור אסטרוציטים אנושיים ראשוניים. ABM+: מכיל את כל התוספים מתערובת התוספים. ABM-: כל התוספים למעט rhEGF ו- FBS
עיט בינוני בזאלי	תרמופישר סיינטיפיק	21010046	BME-1
F-12 Ham בינוני/מזין של Dulbecco	גיבקו	21331-020	ספציפית לתרבית של הכדורים שמקורם במטופל שבודדו במעבדה שלנו, עשויים להשתנות עבור קווי תאי גליומה אחרים
גריינר CELLSTAR 96 צלחות באר S	סיגמא-אולדריץ'	גריינר 655090	בארות פוליסטירן שחורות תחתית שטוחה (עם תחתית מיקרו שקופה)
מלח נתרן פלואורסצאין	סיגמא-אולדריץ'	F6377
קורא צלחות מיקרו אומגה FLUOstar	BMG Labtech
תאים
בנד3	ATCC	CRL-2299	תרבית בתרבית: DMEM (1 גרם / ליטר גלוקוז) בתוספת 10% FBS, 5 מ"ל L-גלוטמין ו 5 מ"ל פניצילין/ סטרפטומיצין
אסטרוציטים של עכברים מונצחים של HIFko	מבודד במעבדת ד"ר גבריאלה ברגרס	https://doi.org/10.1016/ S1535-6108(03)00194-6	בתרבית: BME-1 בתוספת FBS 5%, 5 מ"ל 1 M HEPES, 5 מ"ל 100 mM נתרן פירובט, 3 גרם D-גלוקוז ו 5 מ"ל פניצילין/ סטרפטומיצין
HuAR2T	מבודד במעבדת ד"ר דאגמר וירת'	https://doi.org/10.1089/ ten.tea.2009.0184	בתרבית: EBM-2 עם SupplementMix
אסטרוציטים ראשוניים אנושיים רגילים	לונזה	CC-2565	תרבותי ב: ABM עם SingleQuots