כל ההליכים המערבים משתתפים אנושיים בוצעו בהתאם להנחיות המוסדיות, הלאומיות והבינלאומיות לרווחת האדם ונבחנו על ידי ועדת הבדיקה המוסדית המקומית.
1. הומוגניזציה
הערה: כל השלבים מבוצעים 4 °C.
- הוסף 1.5 מ"ל טריקאין (15 מ"ל) לצלחות פטרי 90 מ"מ המכילות 50 זחלים ב 50 מ"ל של עובר E3 בינוני שטופל ב 200 מיקרומטר PTU כדי להרדים אותם סופנית.
- למצוץ 10 זחלים מורדמים מכלי פטרי עם פיפטה בתפזורת פלסטיק פסטר 3 מ"ל.
- מעבירים זחלים מורדמים 10 על 10 לצלחת פטרי בקוטר 55 מ"מ מלאה בעובר E3 קר כקרח בינוני + טריקאין.
- תחת סטריאומיקרוסקופ, יישרו 10 זחלים במרכז צלחת הפטרי. לאחר מכן, העבירו את ראשי הזחלים מעל שק החלמון באמצעות מיקרו-מספריים כירורגיים (לא כולל שלפוחית שחייה כדי למנוע ראשים צפים).
- למצוץ ראשים מן הכלים פטרי עם 3 מ"ל פסטר פלסטיק פיפטה בתפזורת. המתן עד שכל הראשים יתאספו בתוך קצה פיפטה ולאחר מכן להעביר אותם לתוך הומוגנייזר זכוכית המכיל 1 מ"ל קר כקרח מדיה A (להעביר בנפח מינימלי כדי להפחית דילול מדיה A על ידי E3 + טריקאין). שמור את הומוגנייזר הזכוכית על קרח. השתמש הומוגנייזר אחד לכל תנאי ניסוי.
- החלף כל צלחת פטרי קטנה המכילה E3 + טריקאין קר כקרח עם אחד חדש כל 30 דקות כדי להבטיח כי transsection מבוצע קר E3 + Tricaine בינוני.
- החלף את מדיה A הקרה כקרח בהומוגנייזר זכוכית כאשר הצבע מתחיל לדהות.
הערה: מדיה דילול יכול לשנות את רקמת הראש עקב שינויי טמפרטורה.
- לאחר איסוף כל הראשים (600 ראשים/מצב), הסירו את הנפח המרבי של מדיה A מההומוגנייזר מזכוכית והחליפו אותו ב-1 מ"ל של מדיה A טרייה קרה כקרח.
- לשבש את רקמת המוח עם הומוגנייזר זכוכית הדוק על קרח. בצע 40 סיבובים של ריסוק וסיבובים עבור 3-5 זחלי dpf ו 50 עבור 7 ו 8 זחלי dpf.
- הוסף 2 מ"ל של מדיה A לתרחיף התא (1 מ"ל ראשי מדיה A/200), אשר ידלל תאים ויפחית את הצטברותם במיאלין כדי להקל על הפרדתם במהלך הצנטריפוגה בתווך שיפוע צפיפות.
- כדי למנוע הצטברות תאים, הפעל את תרחיף התא דרך מסננת תאים של 40 מיקרומטר המונחת על גבי צינור בז קר של 50 מ"ל הנשמר על קרח. חזור על פעולה זו 3 פעמים.
- העבר 1 מ"ל של תרחיף התא לתוך צינורות קרים 1.5 מ"ל ולסובב אותם ב 300 גרם במשך 10 דקות ב 4 ° C.
- הסר supernatant באמצעות מזרק 10mL + מחט 23G x 1''.
- השהה מחדש את גלולת התא עם 1 מ"ל של מדיום שיפוע בצפיפות 22% קר כקרח בעדינות על ידי 0.5 מ"ל של DPBS קר כקרח 1x (אין לערבב אותם, ייראה שלב ביניים בין שני התמיסות).
- צינורות סחרור ב-950 גרם ללא בלימה והאצה איטית למשך 30 דקות ב-4°C.
הערה: שלב זה מפריד את המיאלין מתאים אחרים על-ידי הדחתו בשלב הביניים של מדיום שיפוע DPBS 1x ו-22% צפיפות, בעוד שתאים יכדורו בתחתית הצינור. הסרת המיאלין יעילה יותר כאשר ריכוז התאים אינו גבוה מדי.
- באמצעות מזרק 10 מ"ל + מחט 23G x 1'' להשליך את המקסימום של DPBS, מדיום שיפוע צפיפות ומיאלין לכודים בשלב הביניים שלהם.
- יש לשטוף תאים עם 0.5 מ"ל של מדיה A + 2% של סרום עיזים רגיל (NGS), ולאחר מכן לסובב צינורות ב 300 גרם במשך 10 דקות ב 4 ° C.
- יש להשליך את המקסימום של הסופר-נטנט, ולאחר מכן לאגד את כל כדורי התא מאותו מצב ניסויי יחד ב-1 מ"ל של מדיה A + 2% NGS.
- אם התאים המעניינים מבטאים מקרופאגים/מיקרוגליה דמויי חלבון פלואורסצנטי מ-mpeg1:eGFP או נוירונים מדג מהונדס NBT:DsRed, העבירו את תרחיף התא דרך מכסה מסננת של 35 מיקרומטר והעבירו אותם לצינורות FACS קרים של 5 מ"ל על קרח, מוגנים מפני אור.
הערה: לחלופין, ניתן לבצע אימונוסטיין של מיקרוגליה.