$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
כל הנהלים הנוגעים למודלים של בעלי חיים נבדקו על ידי הוועדה המוסדית המקומית לטיפול בבעלי חיים ועל ידי ועדת הבדיקה הווטרינרית JoVE.
1. מיקרוגליה Immunostaining
הערה: כל השלבים מבוצעים ב- 4 °C.
- להשעות מחדש את גלולת התא המתקבל מתאי תרבית המוח עם 0.3 מ"ל של מדיה A + 2% סרום עיזים רגיל או NGS. פצלו אותם ל-3 צינורות בגודל 1.5 מ"ל: אחד לתאים לא מוכתמים למדידת פלואורסצנטיות אוטומטית מתאים מעניינים, השני לנוגדן המשני (1/200) למדידת הקישור הלא ספציפי של הנוגדן המשני למיקרוגליה, והשלישי כבדיקה (נוגדן חד-שבטי עכברי 4C4 (ספציפי למיקרוגליה) (1/20) + נוגדן משני (1/200)).
- הוסף אנדוטוקסין נמוך, ללא אזיד (LEAF) ב -1% לתאים (כל הצינורות) כדי לחסום אינטראקציות CD16 / CD32 עם תחום Fc של אימונוגלובולינים. לדגור על תאים במשך 10 דקות עם תסיסה עדינה כל 5 דקות.
- הוסף את נוגדן 4C4 (1/20) לתאים (צינור 3) ודגר במשך 30 דקות עם תסיסה עדינה כל 10 דקות.
- סובב צינורות ב 300 גרם במשך 10 דקות ב 4 ° C, ולאחר מכן להשליך את supernatant.
- יש לשטוף פעם אחת עם 0.5 מ"ל של חומרי הדפסה A + 2% NGS, ולאחר מכן לסחור בצינורות במהירות של 300 x גרם למשך 10 דקות ב-4°C.
- גלולת תא השהיה עם 0.5 מ"ל של מדיה A + 2% NGS ודגרה על תאים עם LEAF ב 1% במשך 10 דקות עם תסיסה עדינה כל 5 דקות.
- הוסף נוגדן משני (1/200) לתאים (צינור 2 ו -3). יש לדגור על התאים במשך 30 דקות עם תסיסה עדינה כל 10 דקות והגנה מפני אור.
- סובב צינורות ב 300 גרם במשך 10 דקות ב 4 ° C, ולאחר מכן להשליך supernatant.
- יש לשטוף פעמיים עם 0.5 מ"ל של מדיה A + 2% NGS, ולאחר מכן להשעות מחדש את גלולת התא עם 1 מ"ל של מדיה A + 2% NGS.
- הפעל את תרחיף התאים דרך מכסה מסננת תאים של 35 מיקרומטר והעבר אותם למיון תאים קרים המופעלים על ידי פלואורסצנטיות 5 מ"ל או צינורות FACS על קרח, מוגנים מפני אור.
2. מיון תאים (FACS)
הערה: בצע את כל השלבים ב- 4 °C.
- מיין נוירונים, מקרופאגים/מיקרוגליה ותאי מיקרוגליה באמצעות FACS.
הערה: שלב זה מבוצע בדרך כלל על-ידי חבר צוות במתקן FACS וההגדרות תלויות בסוג הציוד שבו נעשה שימוש.
- הוסף DAPI בריכוז של 1 מיקרוגרם/מ"ל בכל צינור FACS כדי לסמן תאים מתים.
- הגדר FACS ומיין נוירונים, מקרופאגים/מיקרוגליה או מיקרוגליה מכל תאי המוח. הפרידו תאים מפסולת בתפקוד גודלם וגרעיניותם, ואז שערו תאים בודדים על ידי פיזור קדימה ופיזור צדדי. אל תכלול תאים מתים על-ידי תיוג DAPI מתאים חיים. זהה נוירונים, מקרופאגים/מיקרוגליה או מיקרוגליה לפי הצביעה החיובית שלהם.
- לאסוף תאים בצינורות 1.5 מ"ל המכילים 1 מ"ל של מדיה קרה כקרח A + 2% NGS על קרח. השתמש בצינורות שונים עבור כל סוג תא.
- סובב צינורות ב 300 x גרם במשך 10 דקות ב 4 ° C ולאחר מכן להשליך את supernatant.
- יש לשטוף פעם אחת עם 0.5 מ"ל של מדיה A ולאחר מכן להשליך את המקסימום של supernatant.