הפלה גנטית בתיווך RNA קצר ב- iHSPCs In Vitro: מערכת ביטוי shRNA מבוססת לנטיוירוס העוברת ל- iHSPCs להפלה של ביטוי גנים ספציפי

תקציר

מקור: Hsiao, Y. L., et al. חקר התפתחות תאים דנדריטיים על ידי הפלה גנטית בתיווך RNA קצר בגזע המטופויטי וקו תאי אב במבחנה. J. Vis. Exp. (2022).

בסרטון זה, אנו מדגימים שיטה לביצוע התמרה של וקטורים לנטי-ויראליים של shRNA כדי להשיג קווי תאים יציבים בתאי גזע ותאי אב המטופויטיים אימורטליים (iHSPCs).

פרוטוקול

1. הכנת קווי גזע ותאי אב המטופויטיים אימורטליים (iHSPCs)

1. שמור על קו תאי iHSPC בתווך RPMI 1640 מלא המכיל 100 ננוגרם/מ"ל FL ו-1 מיקרומטר β-אסטרדיול.
2. מעבר התאים ביחס של 1:10 כל 3 ימים.
   הערה: הפוך RPMI 1640 בינוני מלא על ידי תוספת עם 10% סרום בקר עוברי (FBS), 5 ^x10-5 M β-mercaptoethanol, ו 10 מיקרוגרם / מ"ל gentamicin. רקומביננטי מורין FL זמין גם מסחרית.

2. התמרה לנטיויראלית

1. לוחות iHSPCs בצפיפות של 1 x 10⁵ תאים/באר בלוחות 12 בארות ב-1 מ"ל של תווך שלם המכיל 100 ננוגרם/מ"ל FL, 1 מיקרומטר β-אסטרדיול ו-8 מיקרוגרם/מ"ל פוליברן.
   הערה: ריכוז הפוליברן תלוי בסוגי התאים והוא בדרך כלל בטווח של 4-8 מק"ג/מ"ל.
2. הוסף לנטיוירוס נושא shRNA בכל באר בריבוי זיהום (MOI) של 100.
   הערה: הווקטור הלנטי-ויראלי הוא pLKO.1-Puro עם סמן בחירת פורומיצין (איור 1). רצפי המטרה של shRNA כנגד LacZ, Tcf4 ו-Id2, בהתאמה, מפורטים בטבלת החומרים. MOI מוגדר על ידי מספר הנגיפים המתווספים לתא במהלך ההדבקה.
   
3. סובבו את הצלחות במהירות של 1,100 x גרם למשך 90 דקות ב-37°C.
4. לדגור על הצלחת המכילה תאים נגועים למשך הלילה בטמפרטורה של 37°C באינקובטור.
   הערה: אם התאים רגישים פוליברן, ולאחר מכן לרענן את התאים עם המדיום המלא ללא פוליברן לאחר זיהום ספין.
5. רענן תאים עם תווך מלא המכיל 100 ng/mL FL ו- 1 μM β-אסטרדיול 24 שעות לאחר ההדבקה.
6. הוסף 6 מיקרוגרם / מ"ל של פורומיצין למדיום כדי לבחור את התאים הנגועים לאחר 24 שעות < נוספות /> הערה: וקטור לנטיויראלי מותמר לוקח בדרך כלל 48 שעות לביטוי גנים, כולל גן עמיד לפורומיצין. ודא כי ריכוז puromycin הוא אופטימלי עבור כל קו התא.
7. רענן את מדיום הבחירה המכיל 100 ng/mL FL, 1 μM β-estradiol ו- 6 μg/mL puromycin כל 3 ימים ושמור על התאים למשך שבוע לפחות כדי להרחיב את תאי iHSPC המומרים ביציבות.
   הערה: בחירת פורומיצין נכנסת לתוקף בדרך כלל 48 שעות מאוחר יותר, ותקופת הבחירה תלויה בסוגי התאים.

תוצאות

איור 1: המבנה של וקטור לנטיויראלי pLKO.1-Puro.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
1.5 מ"ל מיקרו צינור	אקסטרג'ין	TUBE-170-C
צלחת מטופלת בתרבית רקמות 12 בארות	בז	353043
סרום בקר עוברי (FBS)	קורנינג	35-010-CV
סל"ד 1640 בינוני	גיבקו	11875-085
β-אסטרדיול	סיגמא-אולדריץ'	E2758-250 מ"ג
β-מרקפטואתנול (β-ME)	סיגמא-אולדריץ'	M6250
ליגנד Flt3 (FL)	תוצרת בית
פוליברן	סיגמא-אולדריץ'	TR-1003-G
פורומיצין	אינוויווגן	ANT-PR-1
shId2 (GCTTATGTCGAATGATAGCAA/TRCN0000054390)	קונסורציום RNAi (TRC)
shLacZ (CGCGATCGTAATCACCCGAGT/TRCN0000072224)	קונסורציום RNAi (TRC)
shTcf4 (GCTGAGTGATTTACTGGATTT/TRCN0000012094)	קונסורציום RNAi (TRC)