All-in-One CRISPR Genome Editing: שיטה להומולוגיה של גנים מבוססי תיקון בתאים בתרבית באמצעות מערכת CRISPR-Cas9

תקציר

מקור: Zhang, L. et al, Gene Knock-in by CRISPR/Cas9 ומיון תאים במקרופאגים ובקווי תאי T. J. Vis. Exp. (2021).

בסרטון זה, אנו מדגימים עריכת גנום מבוססת CRISPR-Cas9 All-in-One בתאים בתרבית, כאשר Cas9 ו-sgRNA מסופקים כמבנה פלסמיד יחיד לתאים. מערכת CRISPR-Cas9 והגן הרצוי להחדרה הוכנסו לתאים באמצעות טכניקת אלקטרופורציה כדי להקל על עריכת גנים מוצלחת.

פרוטוקול

1. אלקטרופורציה של מקרופאגים וקווי תאי T

1. הכנת תרביות תאים לאלקטרופורציה
   1. הכינו את Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 בתוספת 10% נסיוב בקר עוברי (FBS) כאמצעי גדילה מלא לתאי Jurkat T. הכינו את מדיום הנשר המעובד (DMEM) של Dulbecco עם 10% FBS לגידול מקרופאגים RAW264.7. יש להשלים את כל מצעי הגידול המלאים עם 100 U/mL פניצילין ו-100 מיקרוגרם/מ"ל סטרפטומיצין (Pen/Strep) למעט מדיה המשמשת לדגירת פוסט-טרנספקציה לפני מיון תאים.
   2. ביצוע תרבית משנה של תאי RAW264.7 ותאי Jurkat T בהתאם להוראות הספק (ראה טבלת חומרים). בעת תרבית משנה של תאי RAW264.7, השתמש בתמיסת טריפסין-EDTA (0.25%) כדי לנתק תאים. השתמש ב- FBS בתוספת DMSO של 10% (v/v) כאמצעי שימור בהקפאה עבור תאי RAW264.7 ו- Jurkat.
   3. לאסוף תאים ב 250 × גרם במשך 5 דקות עבור מקרופאגים RAW264.7 ו 90 × גרם במשך 8 דקות עבור תאי Jurkat T. לאחר מכן לשטוף עם 5-10 מ"ל של 1× DPBS (ללא Ca²⁺ או מ"ג²⁺ יונים). הסר את DPBS.
   4. להשעות מחדש את גלולת התא באמצעות 2 מ"ל של 1× DPBS. השתמש ב- 10 μL של תאים וערבב עם נפח שווה של 0.2% כחול טריפאן כדי להעריך את ספירת התאים ואת הכדאיות.
      הערה: ודא כי תרבית התא יש >90% קיימא ביום של transfection.
   5. עבור ניסוי נוק-אין יחיד, בצע אלקטרופורציה עם קצוות נוקלאופקציה של 10 μL עם חמש חזרות. חשב את הנפח הדרוש עבור 2.0 × 106 תאים ו pellet את התאים על ידי צנטריפוגה. שטף שוב את גלולת התא עם 1× DPBS כמתואר בשלב 1.1.2.
      הערה: בעת שימוש 10 μL nucleofection טיפים, 4.0 × 10⁵ תאים נדרשים לכל אלקטרופורציה. בהתאם לכך, הכינו לפחות 2.0 × 10⁶ תאים לניסוי נוק-אין אחד.
   6. הכינו צלחת 24 בארות עם 0.5 מ"ל של מדיום צמיחה מלא (מוכן בשלב 1.1.1) לכל באר ללא עט / Strep ולחמם מראש באינקובטור 37 מעלות צלזיוס.

2. אלקטרופורציה של רכיבי CRISPR/Cas9 ווקטור המטרה

1. הפעל את מערכת האלקטרופורציה. השתמש בפרמטרים אלקטרופורציה הממוטבים באופן הבא: 1,400 V/20 ms/2 פולסים עבור מקרופאגים RAW264.7 ו- 1350 V/20 ms/2 פולסים עבור תאי Jurkat T.
2. אם ניקח בחשבון אובדן דגימה כתוצאה מצנרת, הכינו תערובת אלקטרופורציה של 55 מיקרו-ליטר בצינור מיקרוצנטריפוגה סטרילי של 1.5 מ"ל המכיל 2.5 מיקרוגרם מכל וקטור CRISPR/Cas9 (pDsR-mR26-sg1 ו-pDsR-mR26-sg2 עבור mRosa26 locus knock-in, ו-pDsR-hR26-sg1 ו-pDsR-hR26-sg2 עבור מוקד hROSA26), 2.4 מיקרוגרם של וקטור המיקוד הלינארי (pKR26-POI-iBFP או pKhR26-POI-iBFP עבור mRosa26 ו-hROSA26 נוק-אין, ליניארי על ידי EcoRI או BamHI), ואת חיץ המתלים R.
   הערה: כדי לחסוך זמן, תערובת אלקטרופורציה ניתן להכין במהלך צנטריפוגה (שלב 1.1.5).
3. השהה מחדש 2.0 × 10⁶ תאים (שהוכנו בשלב 1.1.5) בתערובת אלקטרופורציה 55 μL משלב 1.2.2.
4. שאפו את תערובת התא/אלקטרופורציה משלב 1.2.3 באמצעות קצה נוקלאופקציה של 10 μL עם פיפטה.
   הערה: במהלך הצנרת, הימנעו מהחדרת בועות אוויר, שעלולות לגרום לכשל אלקטרופורציה.
5. הוסף את הדגימה לצינור מלא 3 מ"ל של Buffer E מערכת אלקטרופורציה.
6. החל את פרמטרי האלקטרופורציה עבור שני סוגי התאים כמתואר בשלב 1.2.1.
7. מעבירים את הדגימה לבאר אחת של צלחת 24 בארות עם תווך שחומם מראש משלב 1.1.6.
8. חזור על שלבים 1.2.4-1.2.7 עבור ארבע החזרות האחרות, כמו גם עבור וקטור היעד בלבד ווקטור ביטוי CRISPR רק controls.
   הערה: שנה את קצה הנוקלאופקציה ואת הצינור בעת מעבר לסוג תא אחר / DNA פלסמיד.
9. תרבית את התאים הנגועים במשך 48-72 שעות כדי לאפשר התאוששות לאחר אלקטרופורציה וביטוי של רכיבי CRISPR/Cas9 לפני ניתוח ציטומטריית זרימה או מיון תאים המופעלים על ידי פלואורסצנטיות (FACS).

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
אמפיצילין, מלח נתרן	MP Biomedicals	194526
Cellometer מיני מונה תאים אוטומטי	Nexcelom Bioscience
DPBS (10X), ללא סידן, ללא מגנזיום	תרמופישר סיינטיפיק	14200075
מדיום עיט מותאם של Dulbecco (DMEM) עם גלוקוז גבוה	הייקלון	SH30022.01
פלקון 5 מ"ל פוליסטירן מבחנה תחתונה עגולה	BD Biosciences	352003
סרום בקר עוברי (FBS)	תרמופישר סיינטיפיק	10099141
יורקאט	ATCC	TIB-152	https://www.atcc.org/
קנמיצין סולפט	MP Biomedicals	194531
פיפטה רב ערוצית (30-300 μL)	Eppendorf, או דומה
מערכת העברת ניאון	תרמופישר סיינטיפיק	MPK5000
מערכת טרנספקציה ניאון, ערכה 10 μL	תרמופישר סיינטיפיק	MPK1096
Nunc 15 מ"ל צינורות צנטריפוגות סטריליות חרוטיות	תרמופישר סיינטיפיק	339651
קצה פיפטה 0.1-20μl	Eppendorf, או דומה	0030 075.005
קצה פיפטה 2-200μl	Eppendorf, או דומה	0030 075.021
קצה פיפטה 50-1000μl	Eppendorf, או דומה	0030 075.064
pX458-DsRed2	אדג'ין	112219
RAW264.7	ATCC	TIB-71	https://www.atcc.org/
סל"ד 1640 בינוני	הייקלון	SH30027.01
פניצילין-סטרפטומיצין	תרמופישר סיינטיפיק	15140122
טריפאן בלו מולנס, 0.4%	תרמופישר סיינטיפיק	15250061
מיקרו-צינוריות 1.5 מ"ל, PCR נקי	Eppendorf, או דומה	0030 125.215
24-צלחות באר שקופות שטופלו ב- TC	קורנינג	3524