Zinc Finger Nuclease-Based Genome Editing: טכניקה לשינוי גנום בתאי גזע פלוריפוטנטיים אנושיים על ידי מנגנון תיקון תלוי הומולוגיה דו-גדילי

כל הנהלים הנוגעים למודלים של בעלי חיים נבדקו על ידי הוועדה המוסדית המקומית לטיפול בבעלי חיים ועל ידי ועדת הבדיקה הווטרינרית JoVE.

1. הכנת תאי גזע לעריכה

1. לגדל ולתרבת תאי גזע פלוריפוטנטיים אנושיים (hPSCs) על צלחת בת 6 בארות המכילה 2.4 × 10⁶ תאים/צלחת של מזיני פיברובלסט עוברי של עכבר מומת C (MEF) הגדלים על ג'לטין. לשמור hPSCs ב 3 מ"ל של מדיה של תאי גזע עובריים אנושיים לכל באר (מדיה hESC) ולגדול באינקובטור 37 ° C עם 3% O₂/5% CO₂.
   הערה: להצלחת פרוטוקול זה, אין צורך לשמור על hPSCs באינקובטור דל חמצן; עם זאת, חשוב לציין כי hPSCs מתרבים מהר יותר בסביבת O₂ גבוהה, ולכן יש להתאים את הזמנים ואת מספרי התאים בהתאם. כמו כן יש לציין כי hPSCs הנשמרים בחמצן נמוך יש שיעורים נמוכים יותר של התמיינות ספונטנית.
   1. כדי לגרום לחומרי הדפסה של 500 מ"ל hESC לשלב 380 מ"ל DMEM/F12, 75 מ"ל סרום בקר עוברי (FBS), 25 מ"ל תחליף סרום נוקאאוט (KSR). הוסף גלוטמין (ריכוז סופי של 1 mM), 5 מ"ל 100x חומצות אמינו לא חיוניות, 100 יחידות/מ"ל פניצילין-סטרפטומיצין (P/S), גורם גדילה פיברובלסט בסיסי (bFGF) (ריכוז סופי של 4 נ"ג/מ"ל), ו-2-מרקפטואתנול (ריכוז סופי של 5.5 מיקרומטר).
2. שינוי מדיה על ידי הסרת כל נפח המדיה (3 מ"ל) באמצעות פיפטה זכוכית ואקום. יש להחליף ב-3 מ"ל חומרי החדר-גזע עובריים חמים באמצעות פיפטה סרולוגית. יש לחזור על שינוי המדיה מדי יום עד שה-hPSCs יהיו בערך 50% נפגשים (יום-1).
3. יום אחד לפני המיקוד (יום-1), החליפו את מדיית ה-hESC, הסירו את המדיה הישנה והוסיפו מדיית hESC חמה בתוספת 10 מיקרומטר Y-27632.
4. גם ביום -1, הכינו צלחת אחת או שתיים של 6 באר או 10 ס"מ של תאי הזנה MEF עמידים לתרופות מעכברי DR4 (2.4 × 10⁶ תאים לצלחת).
   הערה: באופן כללי, 6 צלחות באר הן יתרון על פני צלחות 10 ס"מ, מכיוון שהן מתאימות ליותר מדיה. 6 צלחות באר גם להבטיח כי שיבוטים שונים מבארות שונות הם עצמאיים. עם זאת, צלחת בקוטר 10 ס"מ תאפשר קטיף קל יותר, בהתאם למיקרוסקופ הזמין לתהליך זה.

2. עריכת תאי גזע פלוריפוטנטיים

1. הכינו תמיסות טרנספקציה על-ידי צנרת של 5 מיקרוגרם כל אחד מ-ZFN 1 ו-2 (איור 1) לתוך צינור של 1.5 מ"ל. פיפטה 30 מיקרוגרם של פלסמיד תיקון לתוך צינור זה גם כן. לבסוף, פיפטה 1x פוספט חוצץ מלוחים (PBS) לתוך הצינור כדי להביא את נפח עד 300 μl.
   הערה: הכינו פלסמידים כמידפר (כל ערכה מתאימה) עם ריכוז מינימלי של 300 ננוגרם/מיקרוליטר על מנת לשמור על הנפח הכולל של תמיסת הטרנספקציה מתחת ל-300 מיקרוליטר. אין צורך לבצע מיצוי פנול/כלורופורם, לינאריות של הפלסמיד, או להשתמש בערכת הכנת פלסמיד ללא אנדוטוקסין.
2. הסר מדיה מתאי גזע PSC באמצעות פיפטה מזכוכית ושואב אבק. פיפטה 2 מ"ל לחמם 1x PBS לתוך כל באר כדי לשטוף את התאים.
3. הסר את PBS מיד באמצעות פיפטה זכוכית ואקום. יש להוסיף 0.5 מ"ל תמיסת טריפסין-EDTA 0.25% ישירות לתאים בכל באר. מניחים באינקובטור (37°C/5% CO,₂/3%, O₂) למשך כ-10 דקות, או עד ששכבת ההזנה מתחילה להתרומם מהצלחת.
4. הוסף 2 מ"ל חומרי כביסה חמים esWash (470 מ"ל DMEM/F12, 25 מ"ל FBS, 100 יחידות/מ"ל P/S) לכל באר כדי לעצור את תגובת הטריפסין.
5. ודא שתאי ההזנה יורדים כגיליון. פיפטה את התוכן של כל באר לתוך צינור חרוטי אחד 50 מ"ל, שילוב כל הבארות. תאי טריטוראט באמצעות פיפטה סרולוגית של 10 מ"ל. אין צורך לשבור את שכבת ההזנה; hPSCs ירדו משכבת ההזנה על ידי טריטורציה עדינה. צריך להיות בערך 15 מ"ל של השעיית התא.
6. הוסף 25 מ"ל של מדיית esWash לצינור כדי להביא את הנפח עד 40 מ"ל בסך הכל. הניחו לגושי הזנה גדולים לשקוע בתחתית הצינור למשך 1-2 דקות. הסר את supernatant (~ 38 מ"ל) מן הצינור באמצעות פיפטה סרולוגית ושקע לתוך צינור חרוטי חדש 50 מ"ל.
7. יש לסחוט כלפי מטה במשך 5 דקות במהירות של 190 x גרם. מוציאים את הסופרנאטנט מהצינור בעזרת פיפטת זכוכית ושואב אבק. הקפד לא להפריע את גלולת התא. להשעות מחדש את התאים ב 500 μl 1x PBS. שלב עם תמיסת טרנספקציה פלסמיד שהוכנה קודם לכן. ספור את התאים בשלב זה. השתמש 5-10 מיליון תאים לכל אלקטרופורציה.
8. פיפטה את כל המתלה 800 μl לתוך קובטה אלקטרופורציה 4 מ"מ, מניחים על קרח במשך 3-5 דקות. תאים אלקטרופורטים באמצעות התוכנית המעריכית על מערכת electroporation עם הפרמטרים הבאים: 250 V, 500 μF, התנגדות ∞, גודל קובטה 4 מ"מ. לאחר ההתחשמלות, הניחו את הקובטה בחזרה על קרח למשך 3 דקות.
   הערה: שימו לב לקבוע הזמן של האלקטרופורציה במערכת האלקטרופורציה. קבוע הזמן משתנה בהתאם למספר התא ולטוהר הדנ"א. טרנספקציות מוצלחות בדרך כלל יש קבוע זמן בין 10-14 msec בעת שימוש בתנאים המפורטים ו פולסר גן II. יעילות אלקטרופורציה נמוכה יותר יכולה להתרחש כאשר קבועי הזמן שונים מערכים אלה.
9. להשהות תאים מחושמלים במדיה hESC חמה של 18 מ"ל בתוספת 10 מיקרומטר Y-27632. צלחת 3 מ"ל של תרחיף תא בודד זה לתוך כל באר של צלחת 6 בארות עם תאי מזין DR4. חזרה לאינקובטור (37°C/5% CO,₂/3%, O₂).

3. בחירת מושבות חיוביות

1. יום 2, הסר את כל המדיה באמצעות פיפטה זכוכית ואקום. יש להחליף ב-3 מ"ל של חומר HESC חם בתוספת 10 מיקרומטר Y-27632. יום 3, להסיר את כל המדיה באמצעות פיפטה זכוכית ואקום. יש להחליף ב-3 מ"ל של חומר אחסון הידרוכלורי חם מבלי לכלול את Y-27632. יום 4, להסיר את כל המדיה באמצעות פיפטה זכוכית ואקום. יש להחליף ב-3 מ"ל של תאי גזע עובריים (HESC) חמים בתוספת אנטיביוטיקה לבחירה. חזרה לאינקובטור (37°C/5% CO₂/3% O₂).
   הערה: סוג האנטיביוטיקה המשמשת יהיה תלוי בקלטת העמידות הכלולה בתבנית התיקון. בעבודה עם WIBR#3 hPSCs (רישום NIH 0079), 0.5 מיקרוגרם/מ"ל פורומיצין, 70 מיקרוגרם/מ"ל G418 (גנטיקה) והיגרומיצין 35 מיקרוגרם/מ"ל שימשו בהצלחה. ריכוזים לברירה צריכים להיקבע אמפירית על ידי קביעת הריכוז המינימלי של אנטיביוטיקה הדרוש להרוג תאים מסוג בר בתוך כשבוע.
2. ימים 5-12, להחליף מדיה מדי יום, להחליף מדיה ישנה בכל פעם עם מדיה hESC חם בתוספת אנטיביוטיקה.
   הערה: צפו לכמות גדולה של מוות תאי. מושבות בודדות יתגלו בסביבות היום 8-10. ניתן להשתמש במדיה רגילה של תאי גזע עובריים ללא אנטיביוטיקה לאחר 12-14 ימים של ברירה רציפה. אם צפיפות התאים גבוהה או מוות תאי איטי, יש להימנע מהחמצה של המדיה וייתכן שיהיה צורך להגדיל את נפח המדיה (עד 4-5 מ"ל) במהלך הימים הראשונים של הבחירה.

איור 1. סכמטי של מיקום AAVS1 ערוך גנטי באמצעות תבנית התיקון AAV-CAGGS-EGFP. שונה מ Hockemeyer et al., 2009.