שילוב גנים ממוקד בתיווך TALEN: שימוש בנוקלאזות ספציפיות לרצף מהונדס להחדרה מדויקת של גן חלבון פלואורסצנטי לתוך hiPSCs

Abstract

מקור: Cerbini, T. et al. Transfection, Selection, and Colony-picking of Human Induced Pluripotent Stem Cells TALEN-targeted with a GFP Gene into the AAVS1 Safe Harbor. J. Vis. Exp. (2015)

סרטון זה מתאר טכניקת עריכת גנום מדויקת בתאי גזע פלוריפוטנטיים המושרים על ידי בני אדם, או hiPSCs, תוך שימוש ב- TALENs כדי ליצור שברים דו-גדיליים בלוקוס ממוקד, ולגרום לתיקון מכוון הומולוגיה לשילוב גנים של חלבון פלואורסצנטי.

Protocol

1. הכנת מטריצת קרום מרתף וציפוי כלי פלסטיק

1. הניחו את מלאי מטריצת קרום המרתף הקפוא מ-20°C על קרח והפשירו למשך הלילה ב-4°C.
2. לאחר ההפשרה, פיפטה 2 מ"ג aliquots של מטריצת קרום מרתף לתוך צינורות אפנדורף מצוננים מראש. יש לאחסן אותם בטמפרטורה של -20°C עד לצורך.
3. כדי להכין צלחות מצופות מטריצת קרום מרתף, הפשירו אליקוט אחד על קרח עד שחתיכת הקרח האחרונה בצינור אפנדורף תיעלם (בדרך כלל תוך ~2 שעות).
4. לאחר ההפשרה, הוסף מטריצת קרום מרתף ל- 12 מ"ל של DMEM/F12 קר (4 ° C) כדי ליצור פתרון ציפוי מטריצת ממברנת מרתף.
5. הוסף פתרון מטריצת קרום מרתף לכלי התרבית המתאים. עבור צלחת 6 באר, לחלק 1 מ"ל לכל באר. סובבו את הצלחת כדי לוודא ....

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
מטריג'ל גורם גדילה מופחת (GFR) מטריצת קרום מרתף, *ללא LDEV, 10 מ"ל	קורנינג	354230	יש לאחסן בטמפרטורה של -20°C.
DMEM/F-12	לייף טכנולוגיות	11320-033	יש לאחסן בטמפרטורה של 4°C.
כוכב 6 צלחות באר מרובות מטופלות היטב TC	קורנינג	3506
Essential 8 בינוני	לייף טכנולוגיות	A1517001	יש לאחסן את הרמה הבסיסית בטמפרטורה של 4°C. יש לאחסן את התוסף בטמפרטורה של -20°C.
Y-27632 דיהידרוכלוריד	טוקריס	1254	יש לאחסן בטמפ' החדר. לאחר המסתו ב- H2O, יש לאחסן ב -20 °C.
נתרן כלורי	סיגמא	S5886-500G
UltraPure 0.5 מטר EDTA, pH 8.0	לייף טכנולוגיות	15575-020
DPBS, ללא סידן, ללא מגנזיום	לייף טכנולוגיות	14190-250
צלחת תרבית 100 מ"מ מטופלת TC	קורנינג	430167
DR4 MEF 2M IRR - אקדמי	GlobalStem	GSC-6204G	יש לאחסן בחנקן נוזלי.
DMEM, גלוקוז גבוה, פירובט	לייף טכנולוגיות	11995-040	יש לאחסן בטמפרטורה של 4°C.
סרום בקר עוברי מוגדר, ממוצא אמריקאי	הייקלון	SH30070.03	יש לאחסן ב-20°C-. להפשיר ב-4°C למשך הלילה ו-aliquot. יש לאחסן את aliquots בטמפרטורה של -20°C עד לצורך.
תמיסת חומצות אמינו לא חיוניות MEM (100X)	לייף טכנולוגיות	11140-050	יש לאחסן בטמפרטורה של 4°C.
יחידת ליבה 4D-Nucleofector	לונזה	AAF-1001B	חלק ממערכת האלקטרופורציה.
4D-Nucleofector X יחידה	לונזה	AAF-1001X	חלק ממערכת האלקטרופורציה.
P3 תא ראשי 4D-נוקלאופקטור X ערכה L (24 RCT)	לונזה	V4XP-3024	עם ההגעה, יש להסיר את תמיסת התאים הראשונית ולהשלים ולאחסן בטמפרטורה של 4°C.
מגיב דיסוציאציה של תאי StemPro Accutase	לייף טכנולוגיות	A1110501	יש לאחסן בטמפרטורה של -20°C. יש להפשיר למשך הלילה ב-4°C ולחמם אליקוט באמבט מים בטמפרטורה של 37°C לפני השימוש.
NutriStem XF/FF מדיום תרבות	סטמג'נט	01-2005	יש לאחסן ב-20°C-. להפשיר למשך הלילה ב-4°C
AAVS1 TALENs (pZT-AAVS1-L1 ו-pZT-AAVS1-R1)	אדג'ין	52637 ו-52638
תורם רקומבינציה הומולוגית AAVS1-CAG-EGFP	אדג'ין	22212
פורומיצין דיהידרוכלוריד	לייף טכנולוגיות	A11138-03	יש לאחסן בטמפרטורה של -20°C. להכין aliquots עבודה של 1 מ"ג / מ"ל ב ddH2O.
פיפטות פסטר חד פעמיות מזכוכית בורוסיליקט	פישר סיינטיפיק	13-678-20א
Sorvall Legend XTR (בקירור), 120 וולט 60 הרץ	תרמו סיינטיפיק	75-004-521
TX-750 4 × 750 מ"ל רוטור דלי מתנדנד	תרמו סיינטיפיק	75003607
טריפאן בלו מולנס, 0.4%	לייף טכנולוגיות	15250-061