שילוב גנים ממוקד בתיווך TALEN: שימוש בנוקלאזות ספציפיות לרצף מהונדס להחדרה מדויקת של גן חלבון פלואורסצנטי לתוך hiPSCs

Abstract

מקור: Cerbini, T. et al. Transfection, Selection, and Colony-picking of Human Induced Pluripotent Stem Cells TALEN-targeted with a GFP Gene into the AAVS1 Safe Harbor. J. Vis. Exp. (2015)

סרטון זה מתאר טכניקת עריכת גנום מדויקת בתאי גזע פלוריפוטנטיים המושרים על ידי בני אדם, או hiPSCs, תוך שימוש ב- TALENs כדי ליצור שברים דו-גדיליים בלוקוס ממוקד, ולגרום לתיקון מכוון הומולוגיה לשילוב גנים של חלבון פלואורסצנטי.

Protocol

1. הכנת מטריצת קרום מרתף וציפוי כלי פלסטיק

1. הניחו את מלאי מטריצת קרום המרתף הקפוא מ-20°C על קרח והפשירו למשך הלילה ב-4°C.
2. לאחר ההפשרה, פיפטה 2 מ"ג aliquots של מטריצת קרום מרתף לתוך צינורות אפנדורף מצוננים מראש. יש לאחסן אותם בטמפרטורה של -20°C עד לצורך.
3. כדי להכין צלחות מצופות מטריצת קרום מרתף, הפשירו אליקוט אחד על קרח עד שחתיכת הקרח האחרונה בצינור אפנדורף תיעלם (בדרך כלל תוך ~2 שעות).
4. לאחר ההפשרה, הוסף מטריצת קרום מרתף ל- 12 מ"ל של DMEM/F12 קר (4 ° C) כדי ליצור פתרון ציפוי מטריצת ממברנת מרתף.
5. הוסף פתרון מטריצת קרום מרתף לכלי התרבית המתאים. עבור צלחת 6 באר, לחלק 1 מ"ל לכל באר. סובבו את הצלחת כדי לוודא שתמיסת מטריצת קרום המרתף מכסה לחלוטין כל באר.
6. יש לאטום את הצלחת/צלחת המצופה במברנה במרתף ולדגור בטמפרטורת החדר למשך שעה לפני השימוש. לחלופין, אחסנו צלחות/כלים מצופים במברנה במרתף בטמפרטורה של 4°C והשתמשו תוך שבועיים מהציפוי.
   הערה: הוסף DMEM/F12 נוסף לצלחת/צלחת מצופה מטריצה של קרום המרתף כדי למנוע התייבשות. לפני השימוש בצלחת/צלחת מצופה מטריצה של קרום מרתף בטמפרטורה של 4°C, הניחו אותה בארון בטיחות ביולוגי ואפשרו לה להגיע לטמפרטורת החדר למשך 30 דקות לפחות.
7. לשאוף מטריצת קרום מרתף לחלוטין לפני תוספת של תווך ותאים.

2. הכנת מדיום E8

1. הכינו תרבית E8 בינונית על ידי הפשרת תוסף E8 למשך הלילה ב 4 °C.
2. יש להסיר 10 מ"ל של מדיום בסיסי E8 מהמלאי של 500 מ"ל ולהשליך.
3. פיפטה כל בקבוקון 10 מ"ל של תוסף E8 ישירות לתוך 490 מ"ל של E8 בינוני בסיסי. אין לחמם מדיום E8 מלא באמבט מים של 37°C, מכיוון שתנודות טמפרטורה חוזרות ונשנות עלולות לפגוע ב-bFGF בתווך E8 המלא.
4. יש להשתמש במדיום E8 מלא תוך שבועיים מהוספת התוסף.

3. הפשרת iPSCs

1. יש להסיר בקבוקון של תאי גזע פלוריפוטנטיים מושרים קפואים מחנקן נוזלי ולהניח על קרח יבש.
2. הפשירו במהירות את הבקבוקון באמבט מים של 37 מעלות צלזיוס; ערבלו את הבקבוקון באמבט המים עד שיישאר רק שבר קרח זעיר
.
3. רססו את הבקבוקון באתנול 70% והעבירו לארון בטיחות ביולוגי.
4. מוסיפים 1 מ"ל בטמפרטורת החדר E8 בינונית ישירות לבקבוקון.
5. באמצעות פיפטה 2 מ"ל, להעביר את תרחיף התא טיפה לתוך 9 מ"ל של מדיום E8 בצינור חרוטי 15 מ"ל. מערבלים את הצינור לעתים קרובות כדי להבטיח שהתאים והמדיום יתערבבו היטב במהירות.
6. צנטריפוגה את התאים ב 200 x גרם במשך 5 דקות.
7. שאפו את הסופרנאטנט והשהו מחדש את כדורית התא בנפח מתאים של E8 בתוספת 10 מיקרומטר Y-27632.
8. הוסף את התאים למספר מתאים של בארות מצופות מטריצת קרום מרתף, ומניחים באינקובטור של 37°C, 5% CO₂ למשך הלילה. מומלץ לצלוח לפחות 0.2 x 10⁶ iPSC לכל באר של צלחת 6 בארות כדי לאפשר התאוששות מהירה לאחר ההפשרה.

4. תחזוקה ומעבר שגרתי של iPSCs

1. יש לרענן את E8 מדיום מדי יום.
2. עקוב אחר המורפולוגיה והמפגש של תאים עם מיקרוסקופ הפוך. iPSCs באיכות גבוהה גדלים במושבות שטוחות עם גבולות ברורים; מושבות בודדות הן בעלות מראה "דמוי אבן מרוצפת".
3. מעבר תאי iPSCs כאשר הם מגיעים ~ 70% מפגש.
4. הכן תמיסת מעבר EDTA על ידי הוספת 0.9 גרם NaCl ו- 500 μl 0.5 M EDTA ל- 500 מ"ל DPBS. מערבבים היטב כדי להמיס NaCl, ומסנן ואקום כדי לעקר. יש לחמם אליקוט של תמיסת המעבר באמבט מים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס לפני המעבר.
5. כדי לעבור, שאפו למדיום תרבית משומש ושטפו תאים פעם אחת בנפח שווה של תמיסת מעבר חמה. לשאוף, ופיפטה מספיק EDTA תמיסת מעבר כדי לצפות את התאים (1 מ"ל לכל באר של צלחת 6 באר).
6. הניחו את התאים תחת מיקרוסקופ הפוך והתבוננו במושבות iPSC. המראה של חורים בתוך מושבות וגבולות מוגבהים צריך להיות ברור בתוך 2 עד 5 דקות.
7. שאפו בזהירות לפתרון המעבר של EDTA.
8. באמצעות פיפטה של 10 מ"ל, מוציאים 4 מ"ל של מדיום E8 (אם משתמשים בצלחת 6 בארות) בלחץ גבוה ישירות לתוך כל באר כדי לעבור.
9. אספו את גושי iPSC ופצלו למספר מתאים של בארות בהתאם ליחס הפיצול מ-1:8 ל-1:12. אין לבצע פיפטה יתר על המידה, שכן פירוק של גושי תאים יגרום לכדאיות ירודה.
10. מניחים את הצלחת באינקובטור, ומנדנדים את הצלחת קדימה ואחורה ומצד לצד מספר פעמים כדי לפזר את התאים.

5. הכנת MEFs ו- iPSCs לטרנספקציה

1. 48 שעות לפני הטרנספקציה, יש להעביר iPSCs ב~1:6 לארבע בארות או יותר של פלטת 6 בארות מצופות ממברנה במרתף, כך שהן יהיו 70% במפגש יומיים לאחר מכן.
2. למחרת, הפשירו DR4 MEFs למדיום MEF המורכב מ-DMEM (גלוקוז גבוה) בתוספת 10% FBS ו-1x MEM-NEAA.
3. צלחת DR4 MEFs לתוך שתי מנות 10 ס"מ ב~ 2 x 10⁴ תאים / סמ"ר ולדגור לילה ב 37 ° C.
4. ביום הטרנספקציה, שנה את מדיום MEF ל- E8 בתוספת 10 מיקרומטר Y-27632 30 דקות לפני ביצוע טרנספקציה על iPSCs.
5. אופציונלי: 4 שעות לפני ההדבקה, יש להשלים תרבית iPSC טרום-טרנספקציה עם Y-27632 בריכוז הסופי של 10 מיקרומטר.

6. טיפול מגיב דיסוציאציה של תאים עדינים והעברה של iPSCs באמצעות מערכת אלקטרופורציה

1. הסר את תמיסת הטרנספקציה של תאים ראשוניים P3 מ- 4 ° C ואפשר לה להגיע לטמפרטורת החדר למשך ~ 30 דקות. הוסף את כל תוספת 100 μl לתמיסת הטרנספקציה לפני השימוש.
2. מגיב דיסוציאציה עדין של תאים חמים באמבט מים של 37 מעלות צלזיוס.
3. השג AAVS1 TALENs (pZT-AAVS1-L1 ו- pZT-AAVS1-R1) ותורם AAVS1-CAG-EGFP מ -20 ° C.
4. הסר iPSCs מהאינקובטור ושטוף פעם אחת עם DPBS.
5. הוסף 1 מ"ל של מגיב דיסוציאציה תאים עדין לכל באר ודגר iPSCs ב 37 ° C במשך 5 דקות, או עד יותר מ 50% מהתאים התנתקו מכלי התרבית.
6. פיפטה את התאים למעלה ולמטה כמה פעמים באמצעות פיפטה p1000 כדי לנתק את כל התאים שנותרו מכלי התרבית, ולפרק גושי iPSC.
7. הוסף 2 מ"ל של מדיום E8 לכל באר ופיפטה למעלה ולמטה מספר פעמים באמצעות פיפטה של 10 מ"ל כדי לפרק עוד יותר גושי תאים לתאים בודדים.
   הערה: יעילות הטרנספקציה יורדת באופן משמעותי אם גושי התאים אינם מפורקים מספיק.
8. אספו iPSCs בצינור חרוטי של 15 מ"ל, וצנטריפוגה במהירות של 100 x גרם למשך 3 דקות.
9. לשאוף סופרנאטנט ולהשהות תאים בכמות מינימלית של מדיום E8.
10. לספור את התאים באמצעות hemocytometer לאחר יישום של כתם חיוני כגון 0.4% Trypan כחול. ודא שהתאים מנותקים מספיק בזמן הספירה (1-3 תאים לכל "גוש").
11. יש לפזר 3 x 10⁶ תאים לתוך כל אחד משני צינורות חרוטי 15 מ"ל, ולסובב שוב למטה ב 100 x גרם במשך 3 דקות.
    הערה: צנטריפוגה במהירות נמוכה מפחיתה את הלחץ על התאים ומאפשרת השעיה מחדש קלה של תאי גזע פלוריפוטנטיים מושרים לפני התחשמלות.
12. הגדר את מערכת האלקטרופורציה לתוכנית ספציפית לסוג התא עבור קו תאי הגזע העוברי האנושי H9 (תוכנית CB-150).
13. לאחר הצנטריפוגה, שואפים את הסופרנאטנט מכדורי התא. לגלולה אחת, הוסף 10 מיקרוגרם של תורם HR כדגימת ביקורת. לגלולה השנייה יש להוסיף 10 מיקרוגרם של תורם HR, יחד עם 5 מיקרוגרם של כל TALEN (pZT-AAVS1-L1 ו-pZT-AAVS1-R1) כדגימת ניסוי.
14. יש להשהות מחדש כל כדורית תא ב-100 μl של תמיסת טרנספקציה ראשונית של תאים P3, ולהעביר לקובטה.
15. בצע את transfection ומיד להוסיף 500 μl של טמפרטורת החדר E8 בינוני לכל cuvette.
16. העבר את תאי הגזע הפלוריפוטנטיים המנוהלים הנגועים לצלחת אחת של 10 ס"מ המכילה DR4 MEFs שהוכנו בשלב 5.4.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
מטריג'ל גורם גדילה מופחת (GFR) מטריצת קרום מרתף, *ללא LDEV, 10 מ"ל	קורנינג	354230	יש לאחסן בטמפרטורה של -20°C.
DMEM/F-12	לייף טכנולוגיות	11320-033	יש לאחסן בטמפרטורה של 4°C.
כוכב 6 צלחות באר מרובות מטופלות היטב TC	קורנינג	3506
Essential 8 בינוני	לייף טכנולוגיות	A1517001	יש לאחסן את הרמה הבסיסית בטמפרטורה של 4°C. יש לאחסן את התוסף בטמפרטורה של -20°C.
Y-27632 דיהידרוכלוריד	טוקריס	1254	יש לאחסן בטמפ' החדר. לאחר המסתו ב- H2O, יש לאחסן ב -20 °C.
נתרן כלורי	סיגמא	S5886-500G
UltraPure 0.5 מטר EDTA, pH 8.0	לייף טכנולוגיות	15575-020
DPBS, ללא סידן, ללא מגנזיום	לייף טכנולוגיות	14190-250
צלחת תרבית 100 מ"מ מטופלת TC	קורנינג	430167
DR4 MEF 2M IRR - אקדמי	GlobalStem	GSC-6204G	יש לאחסן בחנקן נוזלי.
DMEM, גלוקוז גבוה, פירובט	לייף טכנולוגיות	11995-040	יש לאחסן בטמפרטורה של 4°C.
סרום בקר עוברי מוגדר, ממוצא אמריקאי	הייקלון	SH30070.03	יש לאחסן ב-20°C-. להפשיר ב-4°C למשך הלילה ו-aliquot. יש לאחסן את aliquots בטמפרטורה של -20°C עד לצורך.
תמיסת חומצות אמינו לא חיוניות MEM (100X)	לייף טכנולוגיות	11140-050	יש לאחסן בטמפרטורה של 4°C.
יחידת ליבה 4D-Nucleofector	לונזה	AAF-1001B	חלק ממערכת האלקטרופורציה.
4D-Nucleofector X יחידה	לונזה	AAF-1001X	חלק ממערכת האלקטרופורציה.
P3 תא ראשי 4D-נוקלאופקטור X ערכה L (24 RCT)	לונזה	V4XP-3024	עם ההגעה, יש להסיר את תמיסת התאים הראשונית ולהשלים ולאחסן בטמפרטורה של 4°C.
מגיב דיסוציאציה של תאי StemPro Accutase	לייף טכנולוגיות	A1110501	יש לאחסן בטמפרטורה של -20°C. יש להפשיר למשך הלילה ב-4°C ולחמם אליקוט באמבט מים בטמפרטורה של 37°C לפני השימוש.
NutriStem XF/FF מדיום תרבות	סטמג'נט	01-2005	יש לאחסן ב-20°C-. להפשיר למשך הלילה ב-4°C
AAVS1 TALENs (pZT-AAVS1-L1 ו-pZT-AAVS1-R1)	אדג'ין	52637 ו-52638
תורם רקומבינציה הומולוגית AAVS1-CAG-EGFP	אדג'ין	22212
פורומיצין דיהידרוכלוריד	לייף טכנולוגיות	A11138-03	יש לאחסן בטמפרטורה של -20°C. להכין aliquots עבודה של 1 מ"ג / מ"ל ב ddH2O.
פיפטות פסטר חד פעמיות מזכוכית בורוסיליקט	פישר סיינטיפיק	13-678-20א
Sorvall Legend XTR (בקירור), 120 וולט 60 הרץ	תרמו סיינטיפיק	75-004-521
TX-750 4 × 750 מ"ל רוטור דלי מתנדנד	תרמו סיינטיפיק	75003607
טריפאן בלו מולנס, 0.4%	לייף טכנולוגיות	15250-061