phiC31-Integrase-Mediated Site-Directed Transgene Integration: טכניקת מיקרו-הזרקה לשילוב טרנסגנים ספציפיים לאתר לווקטור אנופלס

1. הכנת פלסמידים לתערובת המיקרו-הזרקה

הערה: הפרוטוקול המתואר כאן כולל שימוש בשני פלסמידים: פלסמיד תורם מתויג attB (אתר התקשרות הנגזר מהחיידק המארח) הנושא את הטרנסגן המעניין, ופלסמיד עוזר המבטא את אינטגראז φC31 תחת רגולציה של מקדם דרוזופילה Hsp70.

1. לטהר פלסמידים של תורמים ועוזרים באמצעות ערכת טיהור פלסמיד ללא אנדוטוקסין.
   הערה: רצף את הכנת הפלסמיד הסופית המשמשת להזרקה כדי לוודא את שלמות כל הרכיבים.
2. שלב כמויות מתאימות של שני הפלסמידים כדי לקבל תערובת עם ריכוז סופי של 350 ng/μL של פלסמיד התורם ו 150 ng/μL של פלסמיד עוזר כאשר משהה מחדש במאגר הזרקה.
   הערה: בעת חישוב נפח התערובת הדרוש, קחו בחשבון כי 10-15 μL מספיקים לכל יום של זריקות מתוכננות וניתן להכין DNA מראש ולאחסן ב -20 °C. דווח גם על ריכוזי פלסמיד עוזר אינטגראז של 60-500 ng/μL וריכוזי פלסמיד תורם של 85-200 ng/μL.
3. לזרז את הדנ"א על ידי הוספת 0.1 נפחים של 3 M נתרן אצטט (pH 5.2) ו 2.5 נפחים של 100% EtOH קר כקרח ומערבולת. משקע לבן צריך להיות גלוי מיד. לאחר תכשירי פלסמיד ראשוניים מרוכזים מאוד (כלומר, ~ 1 מיקרוגרם / μL) משפר את יעילות המשקעים.
   הערה: נקודת עצירה - ניתן לאחסן את המשקע ב -20 ° C למשך הלילה.
4. צנטריפוגה ב 15,000 x גרם במשך 20 דקות ב 4 ° C, להשליך את supernatant, ולשטוף את הגלולה עם 1 מ"ל של קר כקרח 70% EtOH.
5. שטפו את הגלולה עם 1 מ"ל של 70% EtOH קר כקרח וצנטריפוגה בטמפרטורה של 15,000 x גרם למשך 5 דקות בטמפרטורת החדר.
6. יש להשליך את הסופרנאטנט מבלי להפריע לגלולה ולייבש באוויר.
7. יש להשהות מחדש את הגלולה במאגר הזרקה 1x (0.1 mM Na₃PO₄, 5 mM KCl, pH 7.2, 0.22 μm מסנן מעוקר) כדי להגיע לריכוז סופי כולל של 500 ng/μL.
   הערה: נניח כי חלק מהדנ"א יאבד במהלך תהליך המשקעים; לכן, הוסף תחילה נפח קטן יותר של חיץ הזרקה, בדוק את הריכוז בספקטרופוטומטר (למשל, ננו-טיפה), ולאחר מכן הוסף נפח נותר מתאים כדי להגיע ל-500 ננוגרם/מיקרוליטר.
8. ודא כי ה- DNA הוא resuspended היטב, להכין aliquots של 10-15 μL כל אחד ולאחסן אותם ב -20 ° C.
9. ביום ההזרקה, הפשיר אליקוט אחד וצנטריפוגה ב 15,000 x גרם במשך 5 דקות כדי להסיר שאריות חלקיקים.
   הערה: שיטה חלופית להסרת חלקיקים היא לסנן את התמיסה דרך מסנן 0.22 מיקרומטר. הימנע מנוכחות של שאריות חלקיקים בתערובת ההזרקה מכיוון שהם מובילים לחסימת מחטים במהלך מיקרו-הזרקה של עובר.

2. מיקרו-הזרקה של עוברים מקו עגינה של אנופלס

1. דם להאכיל יתושים בני 4-7 ימים מקו העגינה הרצוי 72 שעות לפני מיקרו-הזרקה (כלומר, להזרקה בימים שני ושלישי להאכיל נקבות ביום שישי הקודם; להזרקה ביום חמישי ושישי להאכיל נקבות ביום שני של אותו שבוע).
2. יתושי בר (WT) ניזונים מדם (כלומר, יתושים עם אותו רקע גנומי של קו העגינה) באותו יום; אלה יידרשו לחצייה.
   הערה: גודל ואיכות ארוחת הדם משפיעים על איכות הביצה, ולכן מומלץ תמיד להשתמש בדם טרי (כלומר, דם שנלקח במהלך 7 הימים האחרונים). האכלת זרועות או האכלה בעכברים עשויה להגדיל את איכות וכמות הביצים, אולם שיטות אלה אינן מעודדות. פרוטוקולים מאושרים ספציפיים יהיו נחוצים לשימוש בבני אדם ובבעלי חיים.
3. ביצוע מיקרו-הזרקות לעוברים
   1. בצע מיקרו-הזרקות של עובר An. gambiae ב- NaCl של 25 mM על ידי מיקוד הקוטב האחורי של העובר בזווית של 45 מעלות. לקבלת פרוטוקול מפורט לאיסוף, יישור ומיקרו-הזרקה עיין בפונדוויל ואחרים.ו-Lobo et al.
   2. בצע מיקרו-הזרקות של עובר An. stephensi בשמן halocarbon 700:27 (2:1) על ידי מיקוד הקוטב האחורי של העובר בזווית של 30 מעלות. פרוטוקול מפורט לאיסוף, יישור ומיקרו-הזרקה של עוברים ניתן למצוא אצל Terenius et al.ו-Lobo et al.
   3. מעבירים ביצים מיד לאחר הזרקתן לצלחת פטרי מלאה במים מזוקקים סטריליים (pH 7.2) ומחזירים אותן לתנאי חרקים.
4. עם הבקיעה, מעבירים את זחלי G₀ למגש עם מים מזוקקים מלוחים (0.1% מלח טוניק) מדי יום ומאחור לגלמים.
5. קצב בקיעה שיא (כלומר, מספר הזחלים שבקעו/מספר העוברים שהוזרקו).
   הערה: תנועת העובר מסייעת לבקיעה, ולכן רצוי ערבול עדין. הבקיעה צריכה להתחיל ~ 48 שעות לאחר ההזרקה. מכיוון שההזרקה עלולה לגרום לעיכוב התפתחותי קל, מומלץ להמשיך לעקוב אחר זחלים הבוקעים מאוחר במשך 3-4 ימים.