$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
1. הכנת פלסמידים לתערובת המיקרו-הזרקה
הערה: הפרוטוקול המתואר כאן כולל שימוש בשני פלסמידים: פלסמיד תורם מתויג attB (אתר התקשרות הנגזר מהחיידק המארח) הנושא את הטרנסגן המעניין, ופלסמיד עוזר המבטא את אינטגראז φC31 תחת רגולציה של מקדם דרוזופילה Hsp70.
- לטהר פלסמידים של תורמים ועוזרים באמצעות ערכת טיהור פלסמיד ללא אנדוטוקסין.
הערה: רצף את הכנת הפלסמיד הסופית המשמשת להזרקה כדי לוודא את שלמות כל הרכיבים.
- שלב כמויות מתאימות של שני הפלסמידים כדי לקבל תערובת עם ריכוז סופי של 350 ng/μL של פלסמיד התורם ו 150 ng/μL של פלסמיד עוזר כאשר משהה מחדש במאגר הזרקה.
הערה: בעת חישוב נפח התערובת הדרוש, קחו בחשבון כי 10-15 μL מספיקים לכל יום של זריקות מתוכננות וניתן להכין DNA מראש ולאחסן ב -20 °C. דווח גם על ריכוזי פלסמיד עוזר אינטגראז של 60-500 ng/μL וריכוזי פלסמיד תורם של 85-200 ng/μL.
- לזרז את הדנ"א על ידי הוספת 0.1 נפחים של 3 M נתרן אצטט (pH 5.2) ו 2.5 נפחים של 100% EtOH קר כקרח ומערבולת. משקע לבן צריך להיות גלוי מיד. לאחר תכשירי פלסמיד ראשוניים מרוכזים מאוד (כלומר, ~ 1 מיקרוגרם / μL) משפר את יעילות המשקעים.
הערה: נקודת עצירה - ניתן לאחסן את המשקע ב -20 ° C למשך הלילה.
- צנטריפוגה ב 15,000 x גרם במשך 20 דקות ב 4 ° C, להשליך את supernatant, ולשטוף את הגלולה עם 1 מ"ל של קר כקרח 70% EtOH.
- שטפו את הגלולה עם 1 מ"ל של 70% EtOH קר כקרח וצנטריפוגה בטמפרטורה של 15,000 x גרם למשך 5 דקות בטמפרטורת החדר.
- יש להשליך את הסופרנאטנט מבלי להפריע לגלולה ולייבש באוויר.
- יש להשהות מחדש את הגלולה במאגר הזרקה 1x (0.1 mM Na3PO4, 5 mM KCl, pH 7.2, 0.22 μm מסנן מעוקר) כדי להגיע לריכוז סופי כולל של 500 ng/μL.
הערה: נניח כי חלק מהדנ"א יאבד במהלך תהליך המשקעים; לכן, הוסף תחילה נפח קטן יותר של חיץ הזרקה, בדוק את הריכוז בספקטרופוטומטר (למשל, ננו-טיפה), ולאחר מכן הוסף נפח נותר מתאים כדי להגיע ל-500 ננוגרם/מיקרוליטר.
- ודא כי ה- DNA הוא resuspended היטב, להכין aliquots של 10-15 μL כל אחד ולאחסן אותם ב -20 ° C.
- ביום ההזרקה, הפשיר אליקוט אחד וצנטריפוגה ב 15,000 x גרם במשך 5 דקות כדי להסיר שאריות חלקיקים.
הערה: שיטה חלופית להסרת חלקיקים היא לסנן את התמיסה דרך מסנן 0.22 מיקרומטר. הימנע מנוכחות של שאריות חלקיקים בתערובת ההזרקה מכיוון שהם מובילים לחסימת מחטים במהלך מיקרו-הזרקה של עובר.
2. מיקרו-הזרקה של עוברים מקו עגינה של אנופלס
- דם להאכיל יתושים בני 4-7 ימים מקו העגינה הרצוי 72 שעות לפני מיקרו-הזרקה (כלומר, להזרקה בימים שני ושלישי להאכיל נקבות ביום שישי הקודם; להזרקה ביום חמישי ושישי להאכיל נקבות ביום שני של אותו שבוע).
- יתושי בר (WT) ניזונים מדם (כלומר, יתושים עם אותו רקע גנומי של קו העגינה) באותו יום; אלה יידרשו לחצייה.
הערה: גודל ואיכות ארוחת הדם משפיעים על איכות הביצה, ולכן מומלץ תמיד להשתמש בדם טרי (כלומר, דם שנלקח במהלך 7 הימים האחרונים). האכלת זרועות או האכלה בעכברים עשויה להגדיל את איכות וכמות הביצים, אולם שיטות אלה אינן מעודדות. פרוטוקולים מאושרים ספציפיים יהיו נחוצים לשימוש בבני אדם ובבעלי חיים.
- ביצוע מיקרו-הזרקות לעוברים
- בצע מיקרו-הזרקות של עובר An. gambiae ב- NaCl של 25 mM על ידי מיקוד הקוטב האחורי של העובר בזווית של 45 מעלות. לקבלת פרוטוקול מפורט לאיסוף, יישור ומיקרו-הזרקה עיין בפונדוויל ואחרים.ו-Lobo et al.
- בצע מיקרו-הזרקות של עובר An. stephensi בשמן halocarbon 700:27 (2:1) על ידי מיקוד הקוטב האחורי של העובר בזווית של 30 מעלות. פרוטוקול מפורט לאיסוף, יישור ומיקרו-הזרקה של עוברים ניתן למצוא אצל Terenius et al.ו-Lobo et al.
- מעבירים ביצים מיד לאחר הזרקתן לצלחת פטרי מלאה במים מזוקקים סטריליים (pH 7.2) ומחזירים אותן לתנאי חרקים.
- עם הבקיעה, מעבירים את זחלי G0 למגש עם מים מזוקקים מלוחים (0.1% מלח טוניק) מדי יום ומאחור לגלמים.
- קצב בקיעה שיא (כלומר, מספר הזחלים שבקעו/מספר העוברים שהוזרקו).
הערה: תנועת העובר מסייעת לבקיעה, ולכן רצוי ערבול עדין. הבקיעה צריכה להתחיל ~ 48 שעות לאחר ההזרקה. מכיוון שההזרקה עלולה לגרום לעיכוב התפתחותי קל, מומלץ להמשיך לעקוב אחר זחלים הבוקעים מאוחר במשך 3-4 ימים.