$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
כל הנהלים הנוגעים למודלים של בעלי חיים נבדקו על ידי הוועדה המוסדית המקומית לטיפול בבעלי חיים ועל ידי ועדת הבדיקה הווטרינרית JoVE.
1. הגדרת פרוטוספייסר ובניית פלסמיד
הערה: בחלק זה מתואר השלב הראשון של בחירת פרוטוספייסרים מתאימים לבניית sgRNA וקשירה נוספת ל-pMaOri.dCas9 (איור 1). רצף פרוטוספייסר זה מורכב מרצף של 20 נוקלאוטידים כנגד המטרה הרצויה.
- להשיג את רצף הנוקלאוטידים של הגן של עניין להשתקה ב GenBank (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank). הגש אותו לשרת האינטרנט CHOPCHOP (http://chopchop.cbu.uib.no/), עם פרמטרים שהוגדרו עבור Streptococcus pyogenes Cas9 ומוטיב protospacer הסמוך NGG לאחר בחירת "Fasta Target". הגדר את הפרמטרים ל- "CRISPR/Cas9" ו- PAM (מוטיב סמוך לפרוטוספייסר) NGG.
- בהתבסס על התוצאות שהתקבלו, בחר פרוטוספייסרים עם הניקוד הטוב ביותר האפשרי (חץ ירוק), הממוקמים קרוב ככל האפשר לקצה 5'end של אזור הקידוד, והכי חשוב, כלולים בגדיל התבנית (מינוס) מכיוון שה- sgRNA חייב להתאים לגדיל הקידוד של הגן להשתקת גנים מלאה.
הערה: מוטיב ה-NGG אינו נכלל ברצף ה-sgRNA הסופי.
- השתמש במקדם lipL32 כדי לבטא את הרנ"א המנחה היחיד המכיל רצף משתנה של 20 נוקלאוטידים בקצה 5' ורצף פיגומים dCas9 שמור. מיזגו את רצף 20-nt, המכונה protospacer, עם מקדם lipL32 (בקצה 5' שלו) ופיגום sgRNA (3'end) (איור 1B).
הערה: עבור מקדם lipL32 מוגדר היטב, השתמש באזור המקדם הכולל -334 ל- TSS (אתר התחלת תמלול, מבוסס על Zhukova et al). בדוק בטבלה 1 את קלטת ה- sgRNA הסופית.
- צור את קלטת sgRNA על ידי PCR רציף או יש אותו מסונתז על ידי ספק מסחרי.
- לאחר קבלת הקלטת, הכניסו אותה לפלסמיד pMaOri.dCas9 באתר הגבלת XmaI בשני קצותיו (cccggg).
- עיכלו גם את קלטת ה-sgRNA וגם את פלסמיד pMaOri.dCas9 עם אנזים הגבלת XmaI והמשיכו לקשירה (איור 1B).
- בצע את שלבי השיבוט בזן E. coli dT auxotrophic π1, עקב מקור השכפול pMaOri (ובהרחבה, pMaOri.dCas9), R6K-gamma.
הערה: לקבלת פרוטוקול מפורט עבור קשירה ובחירת שיבוט, עיין בפרסומים קודמים של פרננדס ונסימנטו. dCas9 מונחה sgRNA ייקשר לגדיל הקידוד של הגן המעניין שנבחר, ולכן יחסום את התארכות ה-RNA פולימראז (איור 1C), וכתוצאה מכך ישתיק גנים.
2. טרנספורמציית לפטוספירה על ידי צימוד
הערה: סכימה גרפית של שלב זה מוצגת באיור 2. כדי ליצור מדיה HAN ולוחות HAN, עיין Hornsby et al. ו Fernandes et al.
- לגדל תאי לפטוספירה פתוגניים ב 29 או 37 ° C במדיה HAN תחת תסיסה על ידי דילול תרבית רוויה HAN טרי ב 1:100; בדרך כלל, L. interrogans serovar קופנהגן זן Fiocruz L1-130 לוקח 4-6 ימים כדי להגיע לצפיפות התאים המתאימה.
- יש לוודא שהתרביות מגיעות ל-O.D. של 0.2-0.4 ב-420 ננומטר (2 עד 5 x 10,8 תאים/מ"ל) לפני השימוש לצמידה.
הערה: מכיוון שמדיית HAN משנה את צבעה ככל שצפיפויות התאים גדלות (עקב אדום פנול הכלול במדיית DMEM), צנטריפוגה (4,000 x גרם, 15 דקות, טמפרטורת החדר) 1 מ"ל של אמצעי התרבית כדי להסיר לפטוספירה ולהחיל supernatant כמו ריק למדידת O.D.
- הפוך את זן E. coli המצומד β2163, auxotrophic עבור חומצה דיאמינופימלית (DAP), עם פלסמיד pMaOri.dCas9 המכיל את קלטת sgRNA. עבור טרנספורמציית E. coli, השתמש בפרוטוקולי הלם חום או אלקטרופורציה. כלול טרנספורמציה עם pMaOri.dCas9 פלסמיד ללא קלטת sgRNA כבקרה.
- לשינוי הלם חום, ערבבו את הדנ"א של פלסמיד (100 ננוגרם) עם תאי E. coli בעלי הכשרה כימית ודגרו על קרח במשך 30 דקות. בצעו שוק חום בטמפרטורה של 42°C במשך 90 שניות והניחו אותו שוב על קרח למשך 5 דקות. שחזרו את התאים על ידי הוספת 1 מ"ל של מדיה LB, דגרו ב 37 °C במשך 1 שעה והמשיכו לציפוי.
- עבור electroporation, להשתמש תאים electrocompetent מעורבב עם 100 ng של DNA פלסמיד. השתמש בפרמטרים הבאים עבור דופק: 1.8 kV, 100 Ω ו- 25 μF. לשחזר את התאים כפי שהוסבר לעיל.
- צלחת את תאי E. coli תורם מותמר במדיום אגר LB בתוספת חומצה דיאמינופימלית (DAP) (0.3 mM) ו spectinomycin (40 מיקרוגרם / מ"ל) כדי לבחור פלסמידים.
- עבור הצמדה, בחר מושבה אחת מכל צלחת יום אחד לפני יום הצמידות (אשר נקבע על ידי ניטור O.D. של תרבויות של leptospires).
- בחר מושבה אחת של E. coli β2163 מלוחות pMaOri.dCas9 הריקים ומושבה אחת מלוחות pMaOri.dCas9sgRNA. אפשר להם לגדול בן לילה ב 10 מ"ל של LB בתוספת DAP ו spectinomycin ב 37 ° C.
- למחרת, לדלל את התרביות הרוויות 1:100 ב 10 מ"ל של LB טרי בתוספת DAP (לא לכלול את האנטיביוטיקה כאן) עד OD420nm של 0.2-0.4. בדרך כלל, לוקח 2-3 שעות ל- E. coli להגיע לצפיפויות אלה.
- בתוך מכסה מנוע בטיחות ביולוגית BSL2, הרכיבו מנגנון סינון על ידי הנחת מסנן קרום קרום אסטרים של תאית מעורבת בקוטר 25 מ"מ, בגודל נקבוביות של 0.1 מיקרומטר, בחלק העליון של בסיס הזכוכית. מניחים משפך זכוכית בנפח 15 מ"ל בחלק העליון ומחזיקים את שני החלקים בעזרת מהדקים קפיציים. חברו את הזכוכית למשאבת ואקום והוסיפו את התרביות למשפך לצורך סינון.
- הוסף 5 מ"ל של תרבית לפטוספירה למשפך. הוסף נפח של E. coli כדי ליצור יחס של 1:1 בהתבסס על ערכי OD420nm של שתי התרבויות. הפעל את משאבת הוואקום ומרכז תאים על ידי סינון. לאחר ריכוז התא במסנן הממברנה, אחזר אותו בזהירות. ודא שהמדיום מסונן דרך הממברנה.
הערה: הסינון אורך 5 עד 10 דקות.
- מקם את המסנן על לוח EMJH זמין מסחרית (ראה טבלת חומרים) בתוספת DAP (0.3 mM). ודאו שצד החיידקים למעלה. לדגור על הצלחות ב 29 ° C במשך 24 h.
הערה: אם משתמשים בלוחות HAN או תוספת EMJH פנימית, E. coli יכול להתרבות ולהתגבר על היחס המיועד של 1:1, אשר בתורו יכול להפחית את יעילות הצמידה.
- לאחר 24 שעות, לשחזר את המסננים מן הלוחות ומניחים כל מסנן בודד בתוך צינור חרוטי 50 מ"ל.
- השתמש 1 מ"ל של מדיום HAN נוזלי כדי לשחרר את התאים משטח המסנן על ידי פיפטינג נרחב מערבול.
- דמיינו את תמיסות החיידקים המעורבים שנמצאו באמצעות מיקרוסקופ שדה כהה כדי לבדוק את כדאיות התא ותנועתיותו, ואת Leptospira:E. coli proportions.
הערה: בשלב זה ניתן לראות מספרים מקבילים של E. coli ו- Leptospira.
- יש למרוח 100-200 מיקרוליטר של תרבית זו על צלחות HAN המכילות 0.4% סרום ארנבים מומת וספקטינומיצין 40 מק"ג/מ"ל. דגירה על צלחות בטמפרטורה של 37°C באטמוספירה של 3% CO2.
חזק>הערה: בדרך כלל, תאי L. interrogans serovar Copenhageni Fiocruz L1-130 יוצרים מושבות תוך 5-7 ימים על לוחות בקרה ותוך 8-10 ימים על לוחות ספקטינומיצין. בשלב זה, E. coli לא יגדל מאז הם auxotrophic עבור DAP.
- כביקורת, לדלל תרביות ב 104 leptospires / מ"ל ולהוסיף 100 μL על צלחות ללא אנטיביוטיקה, לניטור צמיחה leptospiral.