siRNA השתקת גנים הפוכה מבוססת טרנספקציה במבחנה: הליך להעברת RNA מפריע קטן בתאים בתרבית כדי להשבית ביטוי גן מטרה

תקציר

מקור: Jager, J. et al.מודל תרבית תאי אדיפוציט לחקר ההשפעה של אפנון חלבון ומיקרו-רנ"א על תפקוד האדיפוציט. J. Vis. Exp. (2021).

בסרטון זה אנו מתארים הליך לביצוע טרנספקציה הפוכה של siRNA לאדיפוציטים כדי לווסת את הביטוי של חלבון מטרה.

פרוטוקול

1. הכנת צלחות מצופות מראש

1. יום לפני או כמה שעות לפני הטרנספקציה, להכין פתרון של קולגן סוג I ב 100 מיקרוגרם / מ"ל ב 30% אתנול מתמיסת מלאי ב 1 מ"ג / מ"ל. מוסיפים 250 μL קולגן לכל באר של צלחת 12 בארות ו 125 μL לכל באר של צלחת 24 בארות, ומפזרים את התמיסה על פני השטח של הבאר.
2. השאירו את הצלחת ללא מכסה מתחת למכסה המנוע עד שהקולגן יתייבש. יש לשטוף פעמיים במי מלח חוצצי פוספט (D-PBS).
   הערה: צלחות מצופות מראש זמינות לרכישה.

2. הכנת תערובת הטרנספקציה

הערה: הריכוז הסופי של siRNA הוא בין 1 ל-100 ננומטר (1 עד 100 pmol של siRNA לכל באר של צלחת בת 12 בארות). הריכוז הסופי של חיקוי miR הוא 10 ננומטר (10 pmol/well). קבע את הריכוז הטוב ביותר של כל siRNA, חיקוי miR או אוליגונוקלאוטיד אחר לפני תחילת הניסוי כדי למנוע השפעות מחוץ למטרה. בצע ניסויי טרנספקציה במשולש כדי להקל על ניתוח סטטיסטי של התוצאות. הכינו את כל הריאגנטים בעודף כדי לקחת בחשבון אובדן נורמלי במהלך פיפטינג.

1. ערבבו על ידי פיפטינג (נפח/נפח) את siRNA (או אוליגונוקלאוטידים אחרים) עם תווך חיוני מינימלי משופר (טבלה 1). דוגרים במשך 5 דקות בטמפרטורת החדר.
2. הוסף את מגיב הטרנספקציה ואת המדיום החיוני המינימלי המשופר ל- siRNA, ופיפט לערבוב (טבלה 1). יש לדגור במשך 20 דקות בטמפרטורת החדר (במהלך תקופה זו, המשיכו לסעיף 3). מוסיפים את תערובת הטרנספקציה לכל באר של הצלחת המצופה קולגן.

3. הכנת אדיפוציטים 3T3-L1

1. שטפו את התאים בצלחת פטרי 100 מ"מ פעמיים עם D-PBS. הוסיפו 5x טריפסין לתאים (1 מ"ל לצלחת של 100 מ"מ), והקפידו לכסות את כל פני השטח בטריפסין. המתן 30 שניות ובזהירות להסיר את טריפסין.
2. לדגור על צלחת פטרי במשך 5-10 דקות ב 37 מעלות צלזיוס באינקובטור. הקש על צלחת 100 מ"מ כדי לנתק את התאים.
3. הוסף 10 מ"ל של DMEM ללא פירובט, 25 mM גלוקוז, 10% FCS, ו 1% פניצילין וסטרפטומיצין כדי לנטרל את טריפסין. בזהירות צינור את המדיום למעלה ולמטה כדי לנתק את התאים הומוגניזציה של השעיית התא.
4. ספור את התאים באמצעות תא ספירה Malassez או מונה תאים אוטומטי, ולהתאים את ריכוז התאים ל 6.25 x 10⁵ תאים / מ"ל של תווך. זרע 800 μL של תרחיף התא / באר של צלחת 12 בארות (5 x 10⁵ תאים) או 400 μl של תרחיף התא / באר של צלחת 24 באר (2.5 x 10⁵ תאים) המכיל את תערובת transfection.
   הערה: צלחת פטרי אחת של 100 מ"מ של אדיפוציטים תאפשר הכנת צלחת אחת של 12 בארות או צלחת אחת של 24 בארות. צלחת 100 מ"מ מכילה בדרך כלל 6-7 x 10⁶ אדיפוציטים, אשר מתאימים 5 x 10⁵ אדיפוציטים לכל באר של צלחת 12 באר.
5. לדגור על הצלחות באינקובטור תרבית תאים (7% CO2 ו 37 ° C), ולא להפריע לתאים במשך 24 שעות. למחרת, בזהירות להחליף את supernatant עם DMEM טרי ללא פירובט, 25 mM גלוקוז, 10% FCS, ו 1% פניצילין סטרפטומיצין.
   הערה: ניתן גם לזרוע את התאים לתוך צלחות מקופות קולגן 48 ו -96 בארות, אבל לנקוט אמצעי זהירות נוספים בעת החלפת המדיה כדי למנוע ניתוק של אדיפוציטים.

	לכל באר (צלחת 12 בארות)	לכל באר (צלחת 24 בארות)
אוליגונוקלאוטידים	20 μL	10 μL
(si-RNA, miR...)
מדיום חיוני מינימלי משופר	20 מיקרוליטר	10 מיקרוליטר
מגיב טרנספקציה	5.6 μL	2.8 מיקרוליטר
מדיום חיוני מינימלי משופר	154.4 מיקרוליטר	77.2 מיקרוליטר
נפח כולל של תערובת טרנספקציה	200 מיקרוליטר	100 מיקרוליטר

טבלה 1: ריאגנטים של טרנספקציה נדרשים עבור תבניות לוחות של 12 בארות ו-24 בארות.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
12 צלחת תרבית רקמות באר	דוטשר	353043
2.5% טריפסין (10x)	גיבקו	15090-046	מדולל עד פי 5 עם D-PBS
2-פרופנול	סיגמא	I9516
3-איזובוטיל-1-מתילקסנטין	סיגמא-אולדריץ'	D5879
אלבומין בסרום בקר (BSA)	סיגמא	A7030
קולגן סוג I מעור עגל	סיגמא-אולדריץ'	C8919
דקסמתזון	סיגמא-אולדריץ'	D1756
די-PBS	גיבקו	14190144
מדיום הנשרים המעובד של דולבקו (DMEM)	גיבקו	41965062	4.5 גרם / ליטר D-גלוקוז; ל-גלוטמין; ללא פירובט
אתנול	סיגמא	51976
מיקרו-רנ"א miRIDIAN מחקה	אופק דיסקברי
siRNA בקרה שלילית עם תווית FAM	Invitrogen	AM4620
סרום עגל יילוד	גיבקו	16010-159
סרום בקר עוברי	גיבקו	10270-106
פניצילין וסטרפטומיצין	גיבקו	15140-122
siRNA בקרה שלילית עם תווית FAM	Invitrogen	AM4620
ON-TARGETplus עכבר Plin1 siRNA SMARTpool	אופק דיסקברי	L-056623-01-0005
מגיב גליצרול חופשי	סיגמא-אולדריץ'	F6428
צלחת פטרי 100 מ"מ x 20 מ"מ	דוטשר	353003
מגיב טרנספקציה (אינטרפרין)	פוליפלוס	409-10
מדיום חיוני מינימלי משופר (Opti-MEM)	גיבקו	31985-047
אינסולין, רקומביננטי אנושי	גיבקו	12585-014