$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
כל הנהלים הנוגעים למודלים של בעלי חיים נבדקו על ידי הוועדה המוסדית המקומית לטיפול בבעלי חיים ועל ידי ועדת הבדיקה הווטרינרית JoVE.
1. טרנספקציה של פלסמיד התגובה המבטא את גן העניין (GOI) לתאי אפיתל מכתשית ראשוניים
- בודדו תאי אפיתל מכתשית מסוג II מריאות של חולדות.
- זרעו את התאים בצפיפות של 1 x 106 תאים / ס"מ2 ב 100 מ"מ צלחות פטרי עם תווך חיוני מינימלי מלא (MEM מלא). MEM מלא הוא תוספת MEM עם 10% FBS, 0.08 מ"ג / L tobramycin, Septra (3 מיקרוגרם / מ"ל trimethoprim ו 17 מיקרוגרם / מ"ל sulfamethoxazole), 0.2% NaHCO3, 0.01 M HEPES (pH = 7.3), ו 2 mM L-גלוטמין. תרבית את התאים במשך 24 שעות ב 37 ° C ב 5% CO2 באינקובטור לח.
- למחרת, מניחים 500 μL של MEM מלא ללא אנטיביוטיקה בכל באר של צלחת חדשה 12 בארות ומחממים מראש את הצלחת ב 37 ° C במשך 30 דקות. במהלך שלב זה, חשוב להשתמש בסרום בקר עוברי ללא טטרציקלינים מזהמים או עם רמה נמוכה מדי כדי להפריע לזירוז.
- הכינו צינורות של 1.5 מ"ל המכילים את הפלסמיד עם ה-GOI המושרה (פלסמיד GOI) והווקטור הרגולטורי (למשל, pTet-Off) על ידי הוספת 1 מיקרוגרם של פלסמיד GOI ו-1 מיקרוגרם של וקטור רגולטורי לכל באר ב-RT. עבור ניסויי ביטוי משותף עם חלבונים קושרי רנ"א (RBP), 1 מיקרוגרם של וקטור מכונן (למשל, pcDNA3) המבטא RPB מעניין מתווסף לתמהיל הדנ"א (איור 4).
- יש לשאוף את המדיום ולשטוף בעדינות את התאים עם PBS (ללא סידן ומגנזיום) שחומם מראש ב-37°C.
- מוסיפים 5 מ"ל של 0.05% טריפסין שחומם מראש ב-37°C ודגרו על התאים עד לניתוק התאים (2-4 דקות). נטרל את הטריפסין על ידי הוספת 10 מ"ל של MEM מלא ללא אנטיביוטיקה.
- אספו את תרחיף התא בצינור של 50 מ"ל, שטפו את צלחת הפטרי עם 4 מ"ל של מדיום כדי לאסוף כמה שיותר תאים שנותרו, ואז צנטריפוגו את תרחיף התא ב 300 x גרם למשך 5 דקות.
- שאפו בעדינות והשליכו את הסופרנאטנט והשעו מחדש את הגלולה ב 1 מ"ל של PBS. לספור ולחשב את מספר התאים באמצעות hemocytometer.
- צנטריפוגה את התאים ב 300 x גרם במשך 5 דקות. בעדינות לשאוף את supernatant ו resuspend את הגלולה בחיץ השעיה בריכוז של 4 x 107 תאים / מ"ל. הוסף את התאים מצינור 1.5 מ"ל שהוכן בשלב 2.4 בריכוז של 400,000 תאים לבאר וערבב אותם בעדינות על ידי פיפטציה למעלה ולמטה.
- הניחו את הצינור במכשיר האלקטרופורציה ומלאו אותו ב-3.5 מ"ל של חיץ אלקטרוליטי.
- הכנס קצה אלקטרודה מצופה זהב לתוך פיפטה על ידי לחיצה מלאה על הבוכנה. מערבבים בעדינות את התוכן של צינור 1.5 מ"ל בזהירות לשאוף את התאים עם פיפטה. היזהר למנוע מבועות אוויר להיכנס לקצה, שכן זה יגרום לקשת חשמלית במהלך אלקטרופורציה ויוביל לירידה ביעילות הטרנספקציה.
- הכנס את פיפטה לתחנת אלקטרופורציה עד שיש צליל לחיצה.
- בחר את פרוטוקול האלקטרופורציה המתאים לתאי אפיתל בנאדיות, המתאים למתח פולס של 1,450 V ו- 2 פולסים ברוחב של 20 אלפיות השנייה, ולחץ על Start במסך המגע.
- מיד לאחר transfection, להסיר את פיפטה ולהעביר את התאים לבאר מלאה בעבר MEM מלא ללא אנטיביוטיקה כי כבר מחומם מראש ל 37 מעלות צלזיוס.
- חזור על שלבים 1.11-1.14 עבור הדגימות הנותרות.
- נערו בעדינות את הצלחת כדי לפזר את התאים באופן שווה על פני הבאר. לדגור על התאים ב 37 ° C ב 5% CO2 באינקובטור לח. לאחר יומיים, להחליף את המדיום עם MEM מלא עם אנטיביוטיקה.
- אשרו את הצלחת הטרנספקציה על-ידי התבוננות בביטוי של eGFP תחת מיקרוסקופ פלואורסצנטי או על-ידי ציטומטריית זרימה באמצעות וקטור בקרה (איור 1).
הערה: שלב זה הוא אופציונלי ודורש שלב טרנספקציה נוסף באמצעות פלסמיד אחר המבטא eGFP, כגון pcDNA3-EGFP.
2. אינדוקציה של עיכוב התמלול של ממשלת ישראל
הערה: ניתן לטפל בתאים מראש עם הטיפולים הרצויים לפני השראת דוקסיציקלין כדי להעריך את השפעתם על יציבות mRNA (איור 3).
- הכינו תמיסת מלאי דוקסיציקלין של 1 מ"ג/מ"ל במים נטולי יונים. אחסן את תמיסת המלאי בטמפרטורה של -20°C המוגנת מפני אור. דוקסיציקלין, נגזרת של טטרציקלין, משמש במקום טטרציקלין מכיוון שיש לו זמן מחצית חיים ארוך יותר (פי 2) מאשר טטרציקלין. יתר על כן, ריכוז נמוך יותר של דוקסיציקלין נדרש להשבתה מוחלטת של אופרון הטט.
הערה: דוקסיציקלין יכול להשפיע על ביטוי mRNA של ממשלת ישראל האנדוגנית. כדי לאמת זאת, יש לבדוק את ההשפעה של טיפול בן 24 שעות עם דוקסיציקלין על תאי מכתשית כדי לאשר היעדר שינויים כלשהם בביטוי GOI (איור 2).
- הכינו תמיסת דוקסיציקלין טרייה של 1 מיקרוגרם/מ"ל ב-MEM מלא 72 שעות לאחר הטרנספקציה וחממו אותה ל-37°C.
- החלף את המדיום ב- 1 מ"ל MEM שלם המכיל 1 מיקרוגרם / מ"ל דוקסיציקלין לכל באר כדי לעכב את שעתוק ממשלת ישראל.
- לדגור על בארות מרובות ב 37 ° C ב 5% CO2 לפרקי זמן שונים מ 15 דקות עד 6 שעות כדי להעריך את מחצית החיים mRNA של ממשלת ישראל.
- בסיום הטיפול, שטפו את התאים עם PBS קר כקרח ושפכו אותם עם ערכת מיצוי פנול-כלורופורם RNA זמינה מסחרית על ידי הוספת 500 מיקרוליטר של חיץ לכל באר וניעור הצלחת כדי להפוך את התאים להומוגניים.
- בודדו את הרנ"א בהתאם לפרוטוקול היצרן. קבע את תפוקת הרנ"א ואת טוהר הרנ"א על ידי ספקטרופוטומטריה ב- 230, 260 ו- 280 ננומטר. דגימות RNA עם יחסים של 260:230 ו-260:280 של 1.8 ו-2.0, בהתאמה, נחשבות טהורות.
הערה: ניתן להשהות את הפרוטוקול כאן.
