טרנספורמציה גנטית בינארית חיידקית מבוססת וקטור כרומוזום מלאכותי בצמחי Arabidopsis: טכניקה ליצירת צמחים טרנסגניים עם החדרת עותק יחיד

תקציר

מקור: Tark-Dame, M., et al. יצירת צמחים טרנסגניים עם תוספות עותק יחיד באמצעות וקטור בינארי BIBAC-GW. J. Vis. Exp. (2018).

בסרטון זה אנו מדגימים יצירה של צמחי ארבידופסיס טרנסגניים המבטאים טרנסגן יציב באמצעות טרנספורמציה גנטית בינארית בינארית מבוססת כרומוזומים מלאכותיים בתיווך אגרובקטריום.

פרוטוקול

1. ארבידופסיס שינוי

1. הכינו את צמחי הארבידופסיס לטרנספורמציה.
   1. מגדלים צמחי ארבידופסיס בחממה או בתא גידול מבוקר אקלים עד שהם פורחים (12 עציצים עם 9 צמחים כל טבילה).
   2. חתכו את הברגים הראשונים כדי לאפשר לברגים משניים נוספים להופיע. הצמחים מוכנים לטבילה 4-6 ימים לאחר הגזירה, כאשר לצמחים יש הרבה ראשי פרחים לא בשלים ולא הרבה סיליקים מופרים.
2. טבילה פרחונית
   1. יש לטבול תפרחות במשך 5-10 שניות בתרחיף אגרובקטריום הנושא T-DNA המשובט עם כרומוזום מלאכותי חיידקי בינארי או BIBAC. השתמש תסיסה עדינה.
   2. עטפו את החלקים שמעל הקרקע של הצמחים בסרט נצמד כדי לשמור על לחות גבוהה, וכסו את העציצים בקופסה כדי לשמור על הצמחים בחושך. דוגרים על הצמחים במשך יומיים בחממה/תא גידול.
   3. מוציאים את הקופסה ואת סרט ההדבקה ומגדלים את הצמחים לבגרות בחממה/תא צמיחה.
      הערה: כדי להגביר את יעילות הטרנספורמציה, ניתן לטבול מחדש את אותם צמחים 7 ימים לאחר הטבילה הראשונה.
   4. קצרו את הזרעים. אגרו ונתחו את הזרעים (T1) של צמחים, שעברו טרנספורמציה באותו מבנה, כקבוצה אחת.
3. מסך לצמחים טרנסגניים.
   1. כדי לסנן צמחים טרנסגניים שעברו טרנספורמציה עם נגזרת pBIBAC-RFP-GW, נתחו את הזרעים באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי. על מנת לזהות ביטוי DsRed במעילי זרעים, דמיינו את הזרעים בעירור של 560 ננומטר ופליטה של 600–650 ננומטר. הפרידו את הזרעים הפלואורסצנטיים ממקביליהם שאינם פלואורסצנטיים באמצעות מלקחיים.
   2. כדי לסנן צמחים טרנסגניים שעברו טרנספורמציה עם נגזרת pBIBAC-BAR-GW, זרעו את הזרעים במגשים מלאים באדמה (~ 2,500 זרעים / 0.1 מ '²). כדי להבטיח פיזור אחיד של זרעים על מגשים, להשהות זרעים באגר 0.1% במדיום Murashige Skoog 0.5x (MS), ולהפיץ את הזרעים באמצעות פיפטה 1 מ"ל.
      הערה: כדי לעורר את הזרעים לנבוט באופן סינכרוני, לדגור את הזרעים לפחות 2 ימים ב 4 °C (75 °F). זה יכול להיעשות לפני או אחרי זריעת הזרעים.
      1. רססו את השתילים בתמיסת גלופוזינט-אמוניום 0.5% שבועיים ושלושה שבועות לאחר הזריעה במגשים. השתמש 500 מ"ל של תמיסת גלופוזינט-אמוניום לכל 1 מ '².
      2. העבירו שתילים ששרדו לעציצים בודדים. תמונה טיפוסית של מגש עם שתילים לפני ואחרי טיפול גלופוזינט-אמוניום (שני) מוצגת באיור 1.
      3. לנתח את Glufosinate-אמוניום עמיד צמחים על ידי PCR עבור נוכחות של המבנה של עניין.
         1. בודדו את הדנ"א הגנומי של הצמח עבור PCR.

תוצאות

איור 1: מגש מלא בשתילי ארבידופסיס לפני ואחרי טיפול בגלופוזינט-אמוניום. שתילים שאינם מבטאים את גן הבר הקיים ב- PBIBAC-BAR-GW T-DNA מתים לאחר שרוססו בתמיסת גלופוזינט-אמוניום. התמונות מראות את אותו מגש שתילים (A) לפני ריסוס בגלופוזינט-אמוניום, 14 יום לאחר הזריעה, ו-(B) 10 ימים לאחר מכן, לאחר ריסוס פעמיים.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
קנמיצין סולפט מונוהידראט	דוצ'פה	K0126
תערובת אנזימים Gateway LR clonase	תרמו-סיינטיפיק - Invitrogen	11791-019
Murashige Skoog בינוני	דוצ'פה	M0221
אגר	ב.ד.	214010
גלופוזינט-אמוניום (בסטה)	באייר	79391781
מכונת הדמיה של זרחן	GE Healthcare מדעי החיים	טייפון FLA 7000
סרט נצמד (עטיפת סרן)	אומנילאבו	1090681
אגרוז	תרמו-סיינטיפיק - Invitrogen	16500