$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
כל הנהלים הנוגעים למודלים של בעלי חיים נבדקו על ידי הוועדה המוסדית המקומית לטיפול בבעלי חיים ועל ידי ועדת הבדיקה הווטרינרית JoVE.
1. עיצוב אוליגו מורפולינו
הערה: רצפים עבור A. mexicanus זמינים דרך הגן של המרכז הלאומי למידע ביוטכנולוגי (NCBI) ו- NCBI SRA (https://www.ncbi.nlm.nih.gov), כמו גם מדפדפן הגנום של אנסמבל (https://www.ensembl.org). בעת תכנון מורפולינו לשימוש הן בצורת פני השטח והן בצורת מערות, חיוני לזהות כל שונות גנטית בין המורפנות בשלב זה, כך שניתן יהיה להימנע מאזורים גנטיים אלה כמטרות למורפולינו. כל וריאציה פולימורפית באתר יעד מורפולינו עלולה להוביל לקשירה לא יעילה. העיצוב דומה למערכות דגים אחרות, כגון דגי זברה, והוכח בעבר כיעיל ב- A. mexicanus.
- Design of translation-block morpholinos
הערה: מורפולינוס חוסם תרגום חוסם תרגום על ידי קשירה לאתר ההתחלה האנדוגני ומונע ממכונות תרגום לקשור את רצף ה-mRNA דרך מכשול סטרי.
1. זהה את אזור הקידוד של גן המטרה החל מאתר ההתחלה ATG.
2. הקלט את 25 זוגות הבסיס הראשונים של רצף היעד על ידי העתקה והדבקה של הרצף בעורך טקסט או מחברת מעבדה.
3. באמצעות תוכנה מקוונת (למשל, http://reverse-complement.com) או תרגום ידני, ליצור את המשלים ההפוך של רצף היעד. שמור את ההשלמה ההפוכה המתקבלת בעורך טקסט או במחברת lab.
4. הזמינו מורפולינו עם רצף משלים הפוך מחברה שמייצרת אוליגונוקלאוטידים. ראה טבלת חומרים לחברות.
2. מיקרו-הזרקות
- הכנת כלים כלליים לזריקות
הערה: ההליכים בסעיף זה תוארו בפירוט במקום אחר, וסקירה כללית עם שינויים קלים מוצגת כאן.
- צור צלחות הזרקה על ידי מזיגת חם 3% agarose מומס במי מערכת דגים לתוך צלחת פטרי 100 מ"ל. בזהירות מניחים תבנית הזרקת ביצים באגרוז טרי שפכו כדי להכין בארות לביצי הדגים. מניחים את הצד של התבנית באגר בזווית של 45 מעלות ולאחר מכן, מורידים אותו לאט לתוך האגרוז; הנמכה איטית של התבנית בזווית מונעת כניסת אוויר מתחת לתבנית. מסירים בעדינות את התבנית ברגע שהאגרוז מתמצק. את הצלחות ניתן לאחסן, אטום, ב 4 ° C עד שבוע אחד.
- איסוף ביציות שלב חד-תאי
- בלילה שבו צפויה הרבייה, בדקו את המכלים כל 15–30 דקות ועקבו אחר ביצים בתחתית המיכל. הביצים נראות שקופות, בקוטר של כ-1 מ"מ.
- השתמשו ברשת דגים עדינה כדי לאסוף ביצים והעבירו אותן לקערת זכוכית מלאה במי מערכת דגים טריים. בדקו את הביציות תחת מיקרוסקופ כדי לוודא שהביצים נמצאות בשלב של תא אחד.
- בעזרת פיפטות זכוכית, מעבירים ביצים חד-תאיות לצלחות ההזרקה. פיפטות זכוכית נדרשות בשלב זה מכיוון שהביצים יידבקו לפלסטיק.
- באמצעות פיפטה, בזהירות לשחרר את הביצים לתוך בארות של צלחת הזרקת agarose מסעיף 2.1. ממלאים את שורות צלחת ההזרקה המחוממת מראש (בטמפרטורת החדר) במספר הביצים המרבי (30-40 בכל שורה, ועד חמש שורות). שורות מלאות עוזרות למנוע מהביציות לזוז במהלך הזריקות. שמור את הביצים hydrated על צלחת ההזרקה עם כמות קטנה של מי מערכת דגים עד ביצוע הזריקות.
- הגדרת הזרקת פיקו והנחיות כלליות לאופטימיזציה של הזרקה
- מלאו מחדש את מחטי ההזרקה באמצעות קצות פיפטה להעמסת ג'ל שנכנסים לתוך הנימים או באמצעות קצוות מיקרופיפטה סטנדרטיים והוספת בולוס 2-4 μL לקצה. לאחר מילוי המחט, השתמש במלקחיים כדי לחתוך את האורך העודף ממחט ההזרקה.
- בצע מיקרו-הזרקות באמצעות מחט המותקנת במיקרומניפולטור, המחוברת למיקרו-מזרק פיקוליטר.
- הגדר את זמן ההזרקה ל- 0.03 שניות ואת הלחץ החוצה ב- ~0.0 psi. לחץ ההזרקה ישתנה בהתאם עם הבדלים קלים בין המחטים, לכן יש לבצע אופטימיזציה להשגת בולוס הזרקה ~ 1.0 nL.
הערה: לחץ ההזרקה הוא לעתים קרובות בטווח של ~ 10-30 psi.
- תקנן את בולוס ההזרקה על ידי הזרקה לשמן מינרלי ומדידת גודל הבולוס עם מיקרומטר שקופיות כדי להשיג נפח הזרקה ~ 1-1.5 nL. כוונן את לחץ ההזרקה (psi) כדי להגדיל או להקטין את נפח הבולוס.
- יש לשאוב מים מהחלק העליון של הביצים באמצעות רקמת מעבדה.
הערה: כוריון ביצי האסטיאנקס מעט קשה יותר לחדירה מאשר ביצי דגי זברה. אנו מוצאים כי משיכת המים מהחלק העליון של הביצים מסייעת להקל על חדירת המחט לתוך הביצה. אופטימיזציה של צלחת יכולה לאפשר ~ 200 ביצים על צלחת אחת.
- השתמש micromanipulator לחדור כל ביצה עם המחט להזריק אותו ישירות לתוך החלמון. לאחר מיקומה בחלמון, יש להזריק את הביצה על ידי לחיצה על כפתור ההזרקה או דוושת ההזרקה של הרגל.
הערה: צלחת מלאה ניתן להזריק בתוך ~ 15 דקות. השלב החד-תאי נמשך ~40 דקות.
- הזרקת מורפולינוס
הערה: כמות המורפולינו הנחוצה להפלה מבלי לגרום לרעילות תצטרך להיות אופטימלית לכל יעד גנטי; עם זאת, ריכוז של 400 pg הוא מקום טוב להתחיל.
- הכינו מורפולינו כך שיוזרקו 400 גרם מורפולינו לכל ביצה. הפשירו מורפולינו על קרח. תמיסת ההזרקה מורכבת ממורפולינו (בריכוז הרצוי), H2O ללא RNase או תמיסה של דניו, ופנול אדום (10% מהנפח הסופי). לדוגמה, ראו טבלה 1.
- יש להזריק 1 nL לכל עובר.