Tol2 Transposon-mediated Zebrafish Transgenesis: הליך ליצירת דגי זברה טרנסגניים בעקבות הזרקה משותפת של מערכת Tol2 לעוברים מופרים של דגי זברה

תקציר

מקור: Silic, M. R., et al. Visualization of Cellular Electrical Activity in Zebrafish Early Embryos and Tumors. J. Vis. Exp. (2018)

בסרטון זה, אנו מדגימים הליך ליצירת קו טרנסגני יציב של דג זברה המבטא באופן מכונן חלבון מחוון מתח פלואורסצנטי בעקבות הזרקה משותפת של מערכת טרנספוזון Tol2 הכוללת את mRNA טרנספוזאז ומבנה טרנספוזון Tol2 המקודד את מחוון המתח הפלואורסצנטי.

פרוטוקול

כל הנהלים הנוגעים למודלים של בעלי חיים נבדקו על ידי הוועדה המוסדית המקומית לטיפול בבעלי חיים ועל ידי ועדת הבדיקה הווטרינרית JoVE.

1. מיקרו-הזרקה

1. הקימו 4-6 מיכלי רבייה עם לפחות 2 זכרים ו-2 נקבות אחר הצהריים שלפני ההזרקה. אסור להאכיל דגים אלה בשעות אחר הצהריים. צעד זה יפחית את כמות פסולת הדגים ויחסוך זמן לנקות אותם למחרת בבוקר, תוך שהוא גם עוזר לעורר תגובת רבייה.
2. למחרת בבוקר, הסר את תמיסת ההזרקה המוכנה הכוללת: (i) מבנה טרנספוזון Tol2 המכיל מקדם יוביקוויטין של דג זברה ואת גן מחוון המתח הפלואורסצנטי חיישן מואץ של פוטנציאלי פעולה 1 (ASAP1), ו- (ii) Tol2 mRNA, מהמקפיא של -80 מעלות צלזיוס, והנח אותו על קרח.
3. משכו את המחיצות במיכלי גידול הדגים ואפשרו לדגים להזדווג. באופן כללי, דגים מטילים ביצים תוך 20-30 דקות לאחר שליפת המחיצה. אם לא, המתן עוד 1-2 שעות. חלק מהדגים עשויים שלא להטיל ביצים כלל. במקרה זה, חזור על ניסוי זה לאיסוף עוברי דגים.
4. בזמן ההמתנה, יש לוודא שיש מחטים מוכנות עם קצה שבור בזווית יצירת קצה משופע עם מלקחיים, או על ידי שבירה על מגב משימה עדין.
   1. משוך מחטים מזכוכית נימית על מושך מיקרופיפטה באמצעות הפרמטרים הבאים: חום 545; משיכה 60; מהירות 80; זמן 250; לחץ 500. שברו את המחט עם מלקחיים מתחת לטווח דיסקציה (עם סרגל עין להערכת קוטר) על ידי החזקת המלקחיים בזווית של כ-45°. קוטר המחט הרצוי יכול להיות משתנה בהתאם להגדרות המיקרו-מזרק, אך קוטר קטן יותר עדיף להפחתת תמותת עוברים.
5. לאחר שהדגים הטילו ביצים, אספו אותם בצלחת פטרי בקוטר 10 ס"מ והביאו אותם לתחום הנתיחה. הסר את כל העוברים החריגים ופסולת הדגים.
6. יש להכניס את העוברים המופרים לתבנית הזרקת אגרוז 3% שהוכנה. הסר עודפי מים כדי לעזור לשמור על העוברים במקומם.
7. לאחר שכל השורות מלאות בעוברים בני קיימא, סדרו אותם כך שכל התאים הבודדים יפנו לאותו כיוון לכיוון המחט, שהוא בערך זווית אופקית של 45 מעלות. זה יהפוך את ההזרקה להרבה יותר קלה בהמשך.
8. בעת לבישת כפפות, השתמש בקצה צינור העמסה של 20 μL והסר 5 μL של המבנה המוכן מהצינור על קרח.
9. הכניסו בזהירות את הקצה לקצה האחורי של צינור הנימים השבור עד למקום שבו הוא מתחיל להקיש כדי לקבל את המגיב קרוב ככל האפשר לקצה. אם עדיין יש בועות אוויר, לנער את המחט, לוודא לא לשבור את הקצה.
10. הכנס את המחט ישר למחזיק מחט המיקרו-הזרקה והדק בזהירות עד שהמחט נשארת במקומה. כוונן את הזווית לכ- 45°.
11. לאחר הכנת המחט וחיבורה, הפעל את המיקרוסקופ ואת מיכל לחץ הגז. מיכלי CO₂ מסחריים טובים בדרך כלל למטרה זו. נפח ההזרקה מותאם על ידי לחץ ההחזקה והפליטה: כ- 0.5 psi להחזקה ו- 30 psi להוצאה. הקפד לבדוק שהפתרון יוצא בעת לחיצה על הדוושה.
12. באמצעות מיקרומטר שלב עם טיפת שמן מינרלי, להתאים את נפח וזרימה של תמיסה לקוטר ~ 150 מיקרומטר (כ 2 nL). ודא כי לחץ הגב יאפשר כמות קטנה לטפטף מתוך המחט. אם אין מספיק לחץ גב, פעולה נימית תגרום לנוזל להיכנס למחט ולהרוס את ה- mRNA.
13. לאחר כיול המחט, התחל להזריק את המבנה לתא היחיד של העוברים המופריים.
    הערה: זה דורש כמות גדולה של תרגול, סבלנות ועדינות, בגלל שקשה לחדור את קרום התא. חשוב להזריק את התמיסה לתוך התא, ולא את החלמון, ליצירת דגי זברה טרנסגניים. זה שונה מהזרקת מורפולינו. זה לא משנה באיזה צד המחט נכנסת לתא כל עוד המבנה נכנס לתא. לטרנסגנזה יהיה שיעור הצלחה נמוך מאוד אם יוזרקו לחלמון במקום לתא. הזרקה חד-תאית חשובה גם היא, או שייווצרו דגי כימרה סומטיים. זה יפחית את הסיכוי שהטרנסגן ייכנס לתאי הנבט.
14. השתמש בקצה חריץ הג'ל כדי לספק גב ששומר על העובר במקומו ומאפשר למחט להפעיל לחץ מבלי להזיז את העובר. ברגע שקצה המחט נמצא בתא הבודד, לחץ על הדוושה כדי לשחרר את כמות התמיסה הרצויה. חזור על תהליך זה עבור כל העוברים.
15. בסיום, העבירו את העוברים המוזרקים לצלחת מסומנת על ידי שטיפתם מחריץ האגרוז במי מערכת דגים ופיפטת העברה חד פעמית בנפח 3.4 מ"ל. אחסנו את העוברים באינקובטור של 28.5 מעלות צלזיוס כדי לאפשר להם להתפתח.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
אגרוז RA	אמרסקו	N605-500G	להכנת ג'ל ההזרקה
היקף חתך שדה בהיר	ניקון	SMZ 745	דכוריונציה, מיקרו-הזרקה, הרכבה
פיפטת העברה חד פעמית 3.4 מ"ל	תרמו סיינטיפיק	13-711-9AM	עוברי דגים והעברת מים
מלקחיים #5	WPI	500342	דכוריונציה ושבירת מחטים
טיפ טעינה	אפנדורף	930001007	להעמסת תמיסת הזרקה למחטים קפילריות
תבנית מיקרו-הזרקה	כלים מדעיים אדפטיביים	טו-1	להכנת מגש עובש אגורס להחזקת עוברי דגים במהלך ההזרקה
מיקרו-מזרק	WPI	משאבת פיקו-משאבה פנאומטית PV820	מזרק מיקרו-הזרקה
מיקרו-מניפולטור	WPI	מיקרו-מזרק MM3301R	פעולת מיקרו-הזרקה
מושך מיקרופיפטה	כלי סאטר	P-1000	להכנת מחט נימית
שמן מינרלי	אמרסקו	J217-500 מ"ל	לכיול נפח ההזרקה
צלחות פטרי מפלסטיק	VWR	25384-088	להחזקת עוברים של דגים או דגים בתהליך הדמיה
מיקרומטר שלב	אם סקופ	MR100	כיול נפח מיקרו-הזרקה
נימי זכוכית דקים לקיר	WPI	TW100F-4	זכוכית גולמית להכנת מחט קפוילרית