עריכת גנים בתיווך PiggyBac transposon בתאי גזע פלוריפוטנטיים מושרים אנושיים: הליך לשילוב גן מעניין בתאי גזע פלוריפוטנטיים מושרים אנושיים באמצעות מערכת PiggyBac Transposon

תקציר

מקור: Garone, M. G. et al. המרה של תאי גזע פלוריפוטנטיים מושרים אנושיים (iPSCs) לנוירונים מוטוריים תפקודיים בעמוד השדרה ובגולגולת באמצעות וקטורים של PiggyBac. J. Vis. Exp. (2019)

סרטון זה מדגים את ההליך ליצירת נוירונים מוטוריים על ידי טרנספקציה של תאי גזע פלוריפוטנטיים מושרים אנושיים עם מערכת טרנספוזון PiggyBac על ידי ביטוי חוץ רחמי של גורמי שעתוק ספציפיים לשושלת.

פרוטוקול

1. יצירת קווי iPSC אינדוקטיביים NIL ו- NIP

1. טרנספקציה של תאים
   1. שטפו את התאים עם PBS (ללא Ca²⁺/Mg²⁺).
   2. הוסף מגיב דיסוציאציה של תאים (ראה טבלת חומרים) (0.35 מ"ל עבור צלחת 35 מ"מ) ודגור ב 37 ° C עד תאים בודדים
   3. מופרדים (5-10 דקות).
   4. השלם בעדינות את הפרדת התאים על ידי פיפטציה למעלה ולמטה עם פיפטור P1000 3-4 פעמים.
   5. יש לאסוף בצינור של 15 מ"ל ולהוסיף PBS (Ca^2+/Mg²⁺ חינם) ל-10 מ"ל. ספור את התאים.
   6. גלולה 10⁶ תאים והשעיה מחדש ב 100 μl של חיץ R (כלול בערכת אלקטרופורציה התא, ראה טבלת חומרים).
   7. הוסף DNA פלסמיד עבור transfection: 4.5 מיקרוגרם של וקטור transposable (epB-Bsd-TT-NIL או epB-Bsd-TT-NIP) ו 0.5 מיקרוגרם של פלסמיד transposase piggyBac.
   8. הדבקה במערכת אלקטרופורציה של התא (ראה טבלת חומרים) על פי הוראות היצרן עם הפרמטרים הבאים: מתח 1,200 וולט, רוחב 30 אלפיות השנייה, פעימה אחת. זרעו את התאים בתווך iPSC אנושי בתוספת 10 מיקרומטר Y-27632 (מעכב רוק, ראו טבלת חומרים) בצלחת מצופה מטריצה בקוטר 6 מ"מ.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
B27	Miltenyi ביוטק	130-093-566	תוסף ללא סרום לתחזוקת תאי עצב
במבנקאי	Nippon Genetics	NGE-BB02	מדיום הקפאת תאים עבור אבות נוירונים מוטוריים
CaCl2	סיגמא-אולדריץ'	C3881	כימיקלים לתמיסות אלקטרופיזיולוגיות
Corning Matrigel hESC Certified Matrix	קורנינג	354277	הכנת קרום מרתף משוחזרת מסרקומה של עכבר Engelbreth-Holm-Swarm (EHS). משמש להדבקת iPSC לתמיכות פלסטיק וזכוכית
קריוסטם ACF הקפאת מדיה	תעשיות ביולוגיות	05-710-1E	מדיום הקפאה עבור תאי גזע פלוריפוטנטיים מושרים אנושיים
דיספסי	גיבקו	17105-041	מגיב לדיסוציאציה עדינה של תאי גזע פלוריפוטנטיים מושרים אנושיים
DMEM/F12	סיגמא-אולדריץ'	D6421-500ML	מדיום בסיסי לתרבית תאים
דוקסיציקלין	סיגמא-אולדריץ'	D9891-1G	משמש להשראת ביטוי טרנסגנים מווקטורים epB-Bsd-TT-NIL ו-epB-Bsd-TT-NIP
DS2U	ויסל	UWWC1-DS2U	קו iPSC אנושי מסחרי
GDNF	פרפרוטק	450-10	גורם נוירוטרופי שמקורו בגליה
קו HiPSC אפיזומלי של Gibco	תרמו פישר סיינטיפיק	A18945	קו iPSC אנושי מסחרי
Hepes	סיגמא-אולדריץ'	H4034	כימיקלים לתמיסות אלקטרופיזיולוגיות
למינין	סיגמא-אולדריץ'	11243217001	מקדם התקשרות וצמיחה של תאים עצביים במבחנה
NEAA	תרמו פישר סיינטיפיק	11140035	חומצות אמינו לא חיוניות. משמש כתוסף למדיום תרבית תאים, כדי להגדיל את גדילת התאים ואת הכדאיות.
ערכת ניאון 100 μL	תרמו פישר סיינטיפיק	MPK10096	ערכת אלקטרופורציה של תאים
מערכת העברת ניאון	תרמו פישר סיינטיפיק	MPK5000	מערכת אלקטרופורציה של תאים
מדיום נוירובזלי	תרמו פישר סיינטיפיק	21103049	תווך בזאלי המיועד לתחזוקה והבשלה ארוכות טווח של אוכלוסיות תאים עצביים ללא צורך בשכבת הזנה אסטרוציטים
NutriStem-XF/FF	תעשיות ביולוגיות	05-100-1א	מדיום תרבות iPSC אנושי
PBS Ca2+/Mg2+ חינם	סיגמא-אולדריץ'	D8537-500ML	חיץ פוספט מלח של Dulbecco, עם סידן, עם מגנזיום
פניצילין/סטרפטומיצין	סיגמא-אולדריץ'	P4333-100ML	תמיסת פניצילין/סטרפטומיצין המשמשת למניעת זיהום תרבית תאים מחיידקים.
Y-27632 (מעכב סלעים)	אנצו מדעי החיים	ALX-270-333-M005	מעכב סלקטיבי חדיר לתאים של חלבון קינאז (ROCK) המכיל סליל מסוג Rho. מגביר את הישרדות iPSC