$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
1. תכנון gRNA עבור וקטור CRISPR-concatemer
הערה: מטרת חלק זה היא להסביר כיצד לבחור באסטרטגיית המיקוד הטובה ביותר וכיצד לתכנן gRNA המכיל שלוחות ספציפיות עבור וקטור CRISPR-concatemer.
- עצבו gRNA כנגד הגנים המעניינים באמצעות כלי תכנון gRNA CRISPR לבחירה. ראה את טבלת החומרים לדוגמה.
הערה: כאשר מתמקדים בזוג גנים פרלוגיים, אף על פי שאפשר לתכנן gRNA אחד לכל גן, מומלץ לתכנן שני gRNA לכל גן כדי להגדיל את הסיכויים להשיג נוקאאוט כפול (איור 1).
- ודא שה- gRNA אינו מכיל את אתר הזיהוי BbsI באמצעות כלי מיפוי הגבלות (עיין בטבלת החומרים לדוגמה).
- הוסף שלוחות וקטוריות ספציפיות של CRISPR-concatemer לכל אוליגו, כפי שמוצג בטבלה 1.
2. שיבוט של gRNA לווקטור CRISPR-concatemer
- זרחן וחישול של אוליגוס
הערה: שלב זה מדגים כיצד לשלול גדילים עליונים ותחתונים עבור כל אוליגו gRNA וכיצד לזרחן את קצותיהם בתגובה אחת.
- הכינו את תערובת התגובה לאוליגוס זרחני וחישול גדילים עליונים ותחתונים על קרח, בהתאם להוראות הבאות.
הערה: ניתן לאגד את כל האוליגוס לתגובה אחת; לדוגמה, במקרה של וקטור 4 gRNA-concatemer, איחד יחד 8 אוליגוס.
- עבור 3 שרשרורים, השתמש בגדיל העליון של 3.0 μL gRNA (1.0 μL מכל gRNA; 10 μM, 1 μL/gRNA), 3.0 μL gRNA גדיל תחתון (1.0 μL מכל gRNA; 10 μM, 1 μL/gRNA), 2.0 μL T4 DNA ligase buffer (10x), 1.0 μL T4 PNK, והוסף H2O עד לנפח כולל של 20.0 μL.
- יש לערבב היטב על ידי פיפטינג ולהפעיל זאת בתרמוסייקל באמצעות ההגדרות הבאות: 37°C למשך 30°C, 95°C למשך 5 דקות, רמפה עד 25°C ב-0.3°C/min, החזיקו ב-4°C.
- Bbsאני מדשדש תגובה
הערה: בחלק זה, אוליגוס gRNA טרום חישול משולבים במיקום המתאים של וקטור השרשור בשלב אחד על ידי מחזורי עיכול וקשירה לסירוגין.
- לדלל את תערובת התגובה 1:100 במים נטולי DNase/RNase כדי ליצור 3 ו-4 וקטורים של שרשור gRNA.
הערה: בעת שיבוט 2 שרשרוני gRNA, שלב זה אינו נחוץ.
- הרכיבו את תגובת הדשדוש של BbsI על קרח, לפי ההוראות שלהלן. כלול פקד שלילי המכיל רק את הווקטור.
- יש להשתמש בווקטור 100 ng CRISPR-concatemer, תערובת אוליגו 10.0 μL, 1.0 μL מאגר אנזים הגבלה המכיל BSA (10x), 1.0 μL DTT (10 mM), 1.0 μL ATP (10 mM), 1.0 μL BbsI, 1.0 μL T7 ligase ו-H2O עד לנפח כולל של 20.0 μL.
- ערבבו היטב על ידי פיפטינג והפעילו זאת בתרמוסייקל באמצעות ההגדרות הבאות: הפעל 50 מחזורים לשיבוט שרשור 3 ו-4 גר-רנ"א ו-25 מחזורים ל-2 שרשורי gRNA, שניהם בטמפרטורה של 37°C למשך 5 דקות, 21°C למשך 5 דקות, החזיקו בטמפרטורה של 37°C למשך 15 דקות, ואז 4°C לנצח.
- טיפול Exonuclease
הערה: שלב זה מומלץ מאוד מכיוון שהוא מגביר את יעילות השיבוט על ידי הסרת עקבות של DNA ליניארי.
- התייחס לתגובת הדשדוש של BbsI עם אקסונוקלאז DNA (ראה טבלת חומרים) באופן הבא.
- קח תערובת קשירה של 11.0 μL מהשלב הקודם (2.2.3), הוסף 1.5 μL exonuclease buffer (10x), 1.5 μL ATP (10 mM), 1.0 μL DNA exonuclease, והעלה את הנפח הכולל ל 15.0 μL עם מים. יש לדגור בטמפרטורה של 37°C למשך 30 דקות ולאחר מכן 70°C למשך 30 דקות.
הערה: שלב זה מסיר כל שארית DNA ליניארי בתערובת ובכך מגביר את יעילות השיבוט.
- השתמש 2 μL של תערובת התגובה לטרנספורמציה לחיידקי E. coli מוכשרים כימית על ידי הלם חום.
הערה: לחלופין, ניתן לאחסן את התגובה עד שבוע ב -20 ° C.
3. טרנספקציה של אורגנואידים במעיים על ידי אלקטרופורציה
הערה: שים לב כי הליך זה מבוסס על הפרוטוקול שפורסם על ידי Fujii et al. בשנת 2015, עם התאמה לתרביות אורגנואידים במעי דק של עכבר.
- טרום אלקטרופורציה
הערה: חלק זה מתאר כיצד להכין את אורגנואידי המעי של העכבר לפני אלקטרופורציה על ידי הסרת כל האנטיביוטיקות והמדיה המותנית ממדיום התרבית שלהם. זה ימנע השפעות רעילות אפשריות במהלך electroporation.
- ביום 0 של הליך הטרנספקציה, לפצל אורגנואידים ביחס של 1:2.
הערה: ניתן להשיג תרביות אורגנואידים במעיים על ידי ביצוע בידוד קריפטה על פי פרוטוקולים שנקבעו בעבר. עיין בטבלה 2 עבור כל הרכבי המדיה.
- בעת פיצול אורגנואידים להתחשמלות, זרעו לפחות 6 בארות של צלחת 48 בארות לכל טרנספקציה.
- זרעו את האורגנואידים בטיפות מטריצה של 20 μL מרתף וגדלו אותם במדיום WENR + Nic (Wnt + EGF + Noggin + R-spondin + Nicotinamide) ב 37 °C, 5% CO2 באינקובטור לח (כפי שתואר קודם לכן).
- ביום השני, יש להחליף את המדיום על-ידי החלפת WENR+Nic ב-250 μL של EN (EGF + Noggin) + CHIR99021 (מעכב גליקוגן סינתאז קינאז-3) + Y-27632 (מעכב ROCK), ללא אנטיביוטיקה (ראה טבלה 2).
הערה: בכל השלבים, כמות המדיום המתווספת לכל באר של צלחת 48 בארות היא 250 μL.
- ביום השלישי, שנה את מדיום האורגנואיד ל- EN + CHIR99021 + Y-27632 + 1.25% v/v Dimethyl sulfoxide (DMSO), ללא אנטיביוטיקה.
- הכנת התאים
הערה: כאן אנו מתארים כיצד לפרק אורגנואידים לצברי תאים קטנים על ידי דיסוציאציה מכנית וכימית. צעדים אלה הם קריטיים להצלחת ההליך.
- ביום 4, לשבש את כיפות מטריצת המרתף באמצעות קצה פיפטה 1 מ"ל ולהעביר אורגנואידים לצינור 1.5 מ"ל. תכולת בריכה של ארבע בארות של צלחת 48 בארות לתוך צינור.
- פירוק מכני של אורגנואידים לשברים קטנים על ידי פיפטציה מעלה ומטה עם פיפטה P200 בערך 200 פעמים. צנטריפוגה בטמפרטורת החדר, 5 דקות ב 600 x גרם.
- הסר את התווך והשהה מחדש את הגלולה ב -1 מ"ל של פרוטאז רקומביננטי בדרגת תרבית תאים (ראה טבלת חומרים). יש לדגור בטמפרטורה של 37°C למשך 5 דקות לכל היותר ולאחר מכן לבדוק טיפה של 50-μL של דגימה תחת מיקרוסקופ אור הפוך עם מטרה 4x.
הערה: צבירים של 10-15 תאים רצויים, שכן זה מגביר את הישרדות התאים לאחר אלקטרופורציה.
- העבירו את תרחיף התא לצינור 15 מ"ל בעל קשירה נמוכה ועצרו את הדיסוציאציה על ידי הוספת 9 מ"ל של תווך בסיסי ללא אנטיביוטיקה (ראה טבלה 2). צנטריפוגה בטמפרטורת החדר, 5 דקות ב 600 x גרם, ולאחר מכן להשליך את supernatant ולהשהות מחדש את הגלולה ב 1 מ"ל של מדיום סרום מופחת (ראה טבלה של חומרים).
- ספור את מספר התאים עם תא Bürker והשתמש במינימום של 1 x 105 תאים לכל תגובת אלקטרופורציה. הוסף 9 מ"ל מדיום סרום מופחת לצינור 15 מ"ל וצנטריפוגה בטמפרטורת החדר, 3 דקות ב 400 x גרם.
- Electroporation
הערה: הסעיפים הבאים מספקים הוראות כיצד לבצע אלקטרופורציה ולגרום לאורגנואידים להתאושש לאחר מכן.
- הסר את כל הסופרנאטנט והשהה מחדש את הגלולה בתמיסת אלקטרופורציה (ראה טבלת חומרים). הוסף כמות כוללת של 10 מיקרוגרם DNA לתרחיף התא והוסף תמיסת אלקטרופורציה לנפח סופי של 100 μL ושמור את תערובת התא-דנ"א על קרח. השתמש בווקטורים של CRISPR-concatamer בשילוב עם פלסמיד ביטוי Cas9 (לדוגמה, Addgene #41815) ביחס של 1:1.
הערה: הנפח הכולל של הדנ"א שנוסף צריך להיות קטן או שווה ל-10% מנפח התגובה הכולל.
- כלול תערובת טרנספקציה נפרדת המכילה פלסמיד GFP כדי להעריך את יעילות הטרנספקציה (לדוגמה, pCMV-GFP, Addgene #11153, או כל פלסמיד גנרי המבטא GFP).
- הוסיפו את תערובת הדנ"א התאית לקובט האלקטרופורציה והניחו אותה בתא האלקטרופורטור. מדוד את העכבה על ידי לחיצה על הכפתור המתאים באלקטרופורטור וודא שהוא 0.030-0.055 kΩ. בצע אלקטרופורציה בהתאם להגדרות המוצגות בטבלה 3.
הערה: אם ערך העכבה חורג מהטווח המותר, התאם את נפח התמיסה בקובט.
- הוסף 400 μL של חיץ אלקטרופורציה + Y-27632 לקובט ולאחר מכן להעביר הכל לצינור 1.5 מ"ל. לדגור בטמפרטורת החדר במשך 30 דקות כדי לאפשר לתאים להתאושש ולאחר מכן לסובב אותם בטמפרטורת החדר במשך 3 דקות ב 400 x גרם.
- הסר את supernatant ו resuspend את הגלולה ב 20 μL / באר של מטריצת מרתף. זרעו כ 1 x 104 עד 1 x 105 תאים לכל באר בצלחת 48 באר ולהוסיף EN + CHIR99021 + Y-27632 + 1.25% v/v DMSO בינוני. לדגור ב 37 °C (77 °F).
- ביום 5, שנו את התווך ל-EN + CHIR99021 + Y-27632, ובדקו את יעילות הטרנספקציה על-ידי התבוננות בביטוי GFP (איור 2). שמור על אורגנואידים בטמפרטורה של 37°C ורענן את EN + CHIR99021 + Y-27632 בינוני לאחר יומיים.
- ביום 9, שנה את המדיום ל- WENR + Nic + Y-27632 ודגור ב- 37 ° C.
הערה: Y-27632 ניתן להסיר לאחר 7-10 ימים (בימים 16-19).
| קלטת 1 | קלטת 2 | קלטת 3 | קלטת 4 |
| רצף (5′-3′) | CACCGG[gRNA1]GT | ACCGG[gRNA2]G | CCGG[gRNA3] | ACACCGG[gRNA4]GTT |
| רצף (5′-3′) | TAAAAC[RC-gRNA1]CC | AAAAC[RC-gRNA2]C | AAAC[RC-gRNA3] | CTAAAAC[RC-gRNA4]CCG |
טבלה 1: תליה עבור כל קלטת של וקטור שרשור CRISPR.
'
| מדיום בסיסי | | הערות |
| יש לאחסן בטמפרטורה של 4°C למשך 4 שבועות | | |
| מדיום תרבית תאים | 500 מ"ל | ראה טבלת חומרים |
| ל-גלוטמין | 100x 5 מ"ל | |
| סוכן חציצה 1 מ | 5 מ"ל | ראה טבלת חומרים |
| פניצילין סטרפטומיצין | 100x 5 מ"ל | |
| WENR + Nic (Wnt + EGF + Noggin + Rspondin + Nicotinamide) | | |
| יש לאחסן ב-4°C למשך שבועיים | | |
| מדיום בסיסי | עד 50 מ"ל | |
| תוסף תזונה ללא סרום תאי עצב (50x) | 1 מ"ל | ראה טבלת חומרים |
| תוסף תזונה ללא סרום תאי עצב (100x) | 500 μL | ראה טבלת חומרים |
| n-אצטיל-ציסטאין (500 מילימול) | 125 מיקרוליטר | |
| עכבר EGF (100 מיקרוגרם/מ"ל) | 25 מיקרוליטר | |
| Noggin עכבר (100 מיקרוגרם/מ"ל) | 50 מיקרוליטר | |
| מדיום מותנה R-ספונדין | 5 מ"ל | |
| מדיום מותנה Wnt3a | 25 מ"ל | |
| ניקוטינאמיד (1 מטר) | 250 מיקרוליטר | |
| EN + CHIR + Y-27632 (EGF + Noggin + CHIR + Y-27632) | | |
| יש לאחסן ב-4°C למשך שבועיים | | |
| בינוני בסיסי עם סטרפטומיצין פניצילין | עד 20 מ"ל | |
| תוסף תזונה ללא סרום תאי עצב (50x) | 400 מיקרוליטר | ראה טבלת חומרים |
| תוסף תזונה ללא סרום תאי עצב (100x) | 200 מיקרוליטר | ראה טבלת חומרים |
| n-אצטיל-ציסטאין (500 מילימול) | 50 מיקרוליטר | |
| עכבר EGF (100 מיקרוגרם/מ"ל) | 10 מיקרוליטר | |
| Noggin עכבר (100 מיקרוגרם/מ"ל) | 20 מיקרוליטר | |
| Y-27632 (10 מיקרומטר) | 20 מיקרוליטר | |
| CHIR99021 (8 מיקרומטר) | 10 מיקרוליטר | |
| EN (EGF + Noggin) | | |
| יש לאחסן בטמפרטורה של 4°C למשך 4 שבועות | | |
| מדיום בסיסי | עד 50 מ"ל | |
| תוסף תזונה ללא סרום תאי עצב (50x) | 1 מ"ל | ראה טבלת חומרים |
| תוסף תזונה ללא סרום תאי עצב (100x) | 500 μL | ראה טבלת חומרים |
| n-אצטיל-ציסטאין (500 מילימול) | 125 מיקרוליטר | |
| עכבר EGF (100 מיקרוגרם/מ"ל) | 25 מיקרוליטר | |
| Noggin עכבר (100 מיקרוגרם/מ"ל) | 50 מיקרוליטר | |
טבלה 2: הרכב מדיה אורגנואידית.
| דופק נקבוב | דופק העברה |
| מתח | 175V | 20V |
| אורך פולס | 5 מטר/שניה | 50msec |
| מרווח דופק | 50msec | 50msec |
| מספר פעימות | 2 | 5 |
| קצב ריקבון | 10% | 40% |
| קוטביות | + | +/- |
טבלה 3: הגדרות אלקטרופורציה.
