מיקרו-הזרקה רובוטית מונחית תמונה: טכניקה אוטומטית בעלת תפוקה גבוהה להעברה מדויקת של רב-סוכרים בעלי תווית פלואורסצנטית לתאים עצביים בודדים בתרביות פרוסות מוח אורגנוטיפיות

תקציר

מקור: Shull, G. et al. מניפולציה של תאי גזע עצביים בודדים ונוירונים בפרוסות מוח באמצעות מיקרו-הזרקה רובוטית. J. Vis. Exp. (2021)

בסרטון זה אנו מדגימים מיקרו-הזרקה רובוטית של רב-סוכרים בעלי תווית פלואורסצנטית לתאי עצב פירמידליים בפרוסות אורגנוטיפיות של מוח עוברי עכבר באמצעות מזרק אוטומטי. המזרק האוטומטי הוא פלטפורמה רובוטית המשתמשת בתמונות המתקבלות ממיקרוסקופ להעברה מדויקת של ביומולקולות מעניינות לתאים בודדים.

פרוטוקול

כל הנהלים הנוגעים למודלים של בעלי חיים נבדקו על ידי הוועדה המוסדית המקומית לטיפול בבעלי חיים ועל ידי ועדת הבדיקה הווטרינרית JoVE.

1. התקנת תוכנה

1. בצע את ההוראות כדי להתקין את התוכנה מ- https://github.com/bsbrl/Autoinjector.

2. הכנת ריאגנטים ופיפטות

1. אגרוז: הכינו 3% אגרוז על ידי המסה נפרדת של 3 גרם אגרוז בטווח רחב ו-3 גרם אגרוז נקודת התכה נמוכה ב-100 מ"ל PBS בדרגת תרבית תאים בשני בקבוקי זכוכית נפרדים של 200 מ"ל, בהתאמה. יש לאחסן בטמפרטורת החדר עד 3 חודשים.
2. תמיסת Tyrode: להמיס 1 גרם של סודיום ביקרבונט ומלח Tyrode (להשתמש בתוכן של הבקבוק כולו) ו 13 מ"ל של 1 M HEPES ב 1 ליטר של מים מזוקקים. כוונן את ה- pH ל- 7.4. סנן את התמיסה דרך מסנן 0.2 מיקרומטר מבקבוק.
3. מדיום תרבית פרוסות (SCM): הוסף 10 מ"ל של סרום חולדה, 1 מ"ל של 2 מ"ל גלוטמין, 1 מ"ל פניצילין-סטרפטומיצין (100x), 1 מ"ל של תוסף N-2 (100x), 2 מ"ל של תוסף B27 (50x) ו 1 מ"ל של HEPES (pH 7.3) חיץ לתוך 84 מ"ל של מדיום נוירובזאלי. Aliquot 5 מ"ל של SCM לתוך צינורות 15 מ"ל. יש לאחסן בטמפרטורה של -20°C.
4. CO_{2-Independent} Microinjection Medium (CIMM): הכינו תמיסת 5x DMEM שונה עם גלוקוז נמוך (ללא פנול אדום) על ידי המסת האבקה ב-200 מ"ל מים מזוקקים. יש לסנן את התמיסה דרך מסנן בגודל 0.2 מיקרומטר (עבור אבקת DMEM, השתמש בתכולת הבקבוק כולו). כדי להכין 100 מ"ל של CIMM, לערבב 20 מ"ל של 5x DMEM תמיסה שונה, 1 מ"ל של חיץ HEPES, 1 מ"ל של תוסף N2 (100x), 2 מ"ל של תוספת B27 (50x), 1 מ"ל של פניצילין-סטרפטומיצין (100x), 1 מ"ל של 2 mM גלוטמין ו 74 מ"ל של מים מזוקקים. אחסנו את התמיסה בטמפרטורה של 4°C.
5. חיץ הרכבה מחדש: הכן את מאגר ההרכבה מחדש על ידי המסת 262 mM NaHCO₃, 0.05 N NaOH, 200 mM HEPES במים מזוקקים. יש לעקר את התמיסה על ידי סינון דרך מערכת סינון 0.22 מיקרומטר בעלת ראש בקבוק לתוך בקבוק זכוכית סטרילי. Aliquot 500 μL של חיץ reconstitution לתוך צינורות microcentrifuge אטום. יש לאחסן בטמפרטורה של 4°C.
6. מלאי צבע מיקרו-הזרקה: ממיסים את הדקסטרן המסומן פלואורסצנטית במים מזוקקים נטולי RNase (ריכוז סופי 10 מיקרוגרם/מיקרוליטר). הכינו 5 μL aliquots ואחסנו ב -20 °C עד לשימוש.
7. משוך את פיפטות המיקרו-הזרקה מנימי זכוכית בורוסיליקט (קוטר חיצוני 1.2 מ"מ, קוטר פנימי 0.94 מ"מ) באמצעות מושך המיקרופיפטה. הגן על פיפטות מפני אבק. אין לאחסן פיפטות במשך יותר מ 2-3 ימים. עבור ניסוי זה, פרמטרי המשיכה היו HEAT: טמפרטורת רמפה +1 – 5; משיכה: 100; VEL: 110; דל: 100. חום ו- VEL הם הפרמטרים המשפיעים על הצורה והגודל ביותר של פיפטה.
   הערה: פיפטת המיקרו-הזרקה האופטימלית היא בעלת קצה ארוך וגמיש, כדי למנוע נזק לתאים במהלך המיקרו-הזרקה.

3. הכנת פרוסת רקמות

1. המיסו את האגרוז הרחב 3% באמצעות תנור מיקרוגל לפני דיסקציה של רקמת המוח. אין לתת לאגרוז להתמצק על ידי שמירה באמבט מים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס לפני ההטבעה. ודא כי פיפטות מוגנים מפני אבק. אין לאחסן פיפטות במשך יותר מ 2-3 ימים.
2. הפשיר aliquot של SCM חם 10-12 מ"ל CIMM ו 20 מ"ל של תמיסה של Tyrode ל 37 ° C באמצעות אמבט מים.
3. ערבבו את הנותב הפלואורסצנטי (Dextran-3000 או Dextran-10000-Alexa מצומד; ריכוז סופי 5-10 מק"ג/μL) עם שאר הכימיקלים שיש להזריק. צנטריפוגה את פתרון microinjection ב 16, 000 x גרם במשך 30 דקות ב 4 ° C. לאסוף את supernatant ולהעביר לתוך צינור חדש. יש לשמור את תמיסת המיקרו-הזרקה על קרח עד לשימוש.
4. השתמש בראשים של עוברי עכבר E13.5-E16.5 כדי להכין פרוסות רקמה אורגנוטיפית של telencephalon. הסר את העור ופתח את הגולגולת באמצעות המלקחיים, נע לאורך קו האמצע. נתחו את המוח העוברי מהגולגולת הפתוחה והסירו את קרומי המוח המכסים את רקמת המוח החל מהצד הגחוני של המוח. השאירו את המוח המנותח כולו בתמיסה של Tyrode על בלוק חימום של 37°C.
   הערה: כל שלבי הדיסקציה המתוארים ב-3.4 חייבים להתבצע בתמיסת טיירוד שחוממה מראש.
5. יוצקים את האגרוז המומס למגוון הרחב לתוך תבנית הטבעה חד פעמית. כאשר האגרוז מקורר ל 38-39 מעלות צלזיוס, בזהירות להעביר את המוח (מקסימום של 4) לתוכו באמצעות פיפטה פסטר. השתמש תמיד בעצות גזירה עבור שלב זה.
6. ערבבו את האגרוז סביב הרקמה באמצעות מרית או זוג מלקחיים Dumont #1 מבלי לגעת ברקמה. תנו לאגרוז להתמצק בטמפרטורת החדר. לאחר שהאגרוז התמצק, קצצו את עודפי האגרוז המקיפים את הרקמה.
7. מלא את מגש המאגר ב- PBS. לכוון את המוח עם הציר הרוסטרו-קאודלי של הרקמה בניצב למגש (השתמש כנקודת ציון בנורות הריח, המייצגות את החלק הרוסטרלי ביותר של המוח). חותכים פרוסות של 250 מיקרומטר בעזרת ויברטום.
8. ממלאים צלחת פטרי בקוטר 3.5 ס"מ ב-2 מ"ל מדיה מחוממת מראש. בעזרת פיפטת פסטר מפלסטיק מעבירים לצלחת פרוסות (10–15). לאחר שתסיימו, העבירו את צלחת הפטרי עם הפרוסות לחממת תרבות הפרוסות. יש לשמור על פרוסות בטמפרטורה של 37°C באווירה לחה המכילה 40% O₂ / 5% CO₂ / 55% N₂ עד לשימוש.

4. מיקרו-הזרקה

1. הפעל את המחשב, המיקרוסקופ, מצלמת המיקרוסקופ, המניפולטורים, מתקן הלחץ וחיישן הלחץ. טען את היישום על ידי לחיצה על הקובץ "launchapp.py" בתיקייה הראשית שהורדה מ- GitHub וציין את הגדרות המכשיר במסך הקופץ (ראה שלב 1.1 לקבלת הוראות התקנה).
2. צור לחץ כלפי חוץ כדי למנוע סתימות לא רצויות לפני השקעת פיפטה בתמיסה. כדי להפעיל לחץ על פיפטה, החלק את סרגל לחץ הפיצוי ל- 24-45% ולחץ על קבע ערכים. לאחר מכן, כוונן את הלחץ ללחץ מספיק על ידי סיבוב ידית שסתום הלחץ המכנית ל- 1-2 PSI (69-138 mbar) כפי שמצוין על ידי חיישן הלחץ.
3. מעבירים את הפרוסות לצלחת פטרי בקוטר 3.5 ס"מ המכילה 2 מ"ל CIMM שחומם מראש. מניחים את הפרוסות להזרקה זעירה במרכז צלחת הפטרי. מעבירים את צלחת הפטרי לשלב המיקרו-הזרקה שחומם מראש (37 מעלות צלזיוס).
4. טען את פיפטת המיקרו-הזרקה עם 1.4-1.6 מיקרוליטר של תמיסה במיקרו-הזרקה (משלב 3.3) באמצעות פיפטה פלסטית בעלת קצה ארוך. הכנס את פיפטת המיקרו-הזרקה למחזיק הפיפטה.
5. באמצעות ההגדלה הנמוכה ביותר במיקרוסקופ, הביאו את הפרוסה למיקוד וכיוונו את המיקרופיפטה לשדה ראייה זה (FOV) כך שהיא תתמקד באותו מישור כמו מטרת הפרוסה. העבר את פלט המיקרוסקופ למצלמה כדי לראות את ה- FOV ביישום.
6. לחץ על לחצן ההגדלה בפינה השמאלית העליונה של הממשק כדי להתחיל בכיול המכשיר. יופיע חלון שיבקש לבחור את ההגדלה. בחר את ההגדלה של 10x, או כל הגדלה שהעדשה מוגדרת אליה (לדוגמה, 4x, 10x, 20x, 40x) ולחץ על OK. התוכנה מניחה שהעדשה האובייקטיבית הפנימית היא פי 10 (הגדלת העדשה האובייקטיבית הנפוצה ביותר).
7. מקדו מחדש את קצה הפיפטה באמצעות הגלגל המיקרומטרי של המיקרוסקופ ולחצו על קצה הפיפטה עם הסמן. לאחר מכן, לחץ על שלב 1.1 כפתור ולחץ אישור בחלון הקופץ. הפיפטה תנוע בכיוון Y. לחץ על קצה פיפטה ולחץ על כפתור שלב 1.2. לבסוף, הזן 45 לתוך תיבת זווית פיפטה ולחץ על הגדר זווית.
8. הזן את הפרמטרים הרצויים בלוח הבקרה האוטומטי של מיקרו-הזרקה. עבור מיקרו-הזרקה לאבות אפיים, הגדר את מרחק ההזרקה ל-20-40 מיקרומטר ואת העומק ל-10-15 מיקרומטר. עבור מיקרו-הזרקה לנוירונים הגדר את מרחק ההזרקה 30-40 מיקרומטר מהצד הבסיסי, ואת העומק ל 10-30 מיקרומטר בהתאם למה שמכוון. הגדר תמיד את המהירות ל- 100%. לחץ על Set values.
   הערה: מרחק הגישה הוא המרחק שהפיפטה שולפת מהרקמה לפני המעבר למרחק ההזרקה הבא, עומק הוא העומק לתוך הרקמה שהמיקרו-הזרקה עוברת, ריווח הוא המרחק לאורך הקו בין זריקות עוקבות, מהירות היא מהירות הפיפטה במיקרומטר לשנייה.
9. לחץ על הלחצן Draw edge וגרור את הסמן לאורך המסלול הרצוי בחלון הנפתח כדי להגדיר את מסלול ההזרקה. עבור מיקרו-הזרקה של תאי גזע אב, הצד הגחוני של משטח הטלנספלון ממוקד. הביאו את הפיפטה לתחילת השורה ולחצו על קצה הפיפטה. לחץ על הפעל מסלול כדי להתחיל במיקרו-הזרקה. חזור על שלב זה עבור כל מישור של הזרקה מכוונת (בדרך כלל נעשה עבור 3-4 מטוסים עם 40-75 זריקות לכל מטוס).

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
כימיקלים
אגרוז, נמס נמוך	קרל רות'	חתול# 6351.2
אגרוז, רכס פראי	סיגמא-אולדריץ'	Cat# A2790
דבק Best-CA 221	הטוב ביותר Klebstoffe GmbH & Co.KG	חתול# CA221-10ml
תוספת B-27	תרמו פישר סיינטיפיק	חתול# 17504044
מים מזוקקים
DMEM-F12, CO2 עצמאי (עם פנול אדום)	סיגמא-אולדריץ'	Cat# D2906
DMEM-F12, עצמאי CO2 (עם פנול אדום)	סיגמא-אולדריץ'	חתול# D8900
HEPES-NAOH, pH 7.2, 1M (חיץ HEPES)	קרל רות'	Cat# 9105.3
ל-גלוטמין, 200 מילימטר	Thermo Fisher Sientific	חתול# 25030024
מויול 4-88	סיגמא-אולדריץ'	חתול# 81381
תוספת N-2	תרמו פישר סיינטיפיק	חתול# 17502048
מדיום נוירובזלי	תרמו פישר סיינטיפיק	חתול# 21103049
מים ללא Nuclease	תרמו פישר סיינטיפיק	Cat# AM9937
O2 (40%), CO2 (5%), N2 (55%) מיקס, 50 ליטר
PBS
פניצילין-סטרפטומיצין (10,000 U/mL)	תרמו פישר סיינטיפיק	חתול# 15140122
נסיוב חולדות	מעבדות נהר צ'ארלס
סודיום ביקרבונט (NaHCO3)	מרק	חתול# 106323
נתרן הידרוקסידי (NaOH)	מרק	חתול# 106482
המלח של טיירוד	סיגמא	Cat# T2145-10x1L)
ציוד
נימי זכוכית בורוסיליקט, קוטר חיצוני 1.2 מ"מ x קוטר פנימי 0.94 מ"מ	סאטר אינסטרומנטס	חתול# BF-120-94-10
מערכת סינון בקבוק-עליון, 500 מ"ל	קורנינג	חתול# 430769
מחשב מחשב
מתקן לחץ מותאם אישית		מתקן לחץ מותאם אישית
וסת לחץ אלקטרוני	פרקר חניפין	חתול# 990-005101-002
צינורות בז, 15 מ"ל	קורנינג	חתול# 430791
צינורות בז, 50 מ"ל	קורנינג	חתול# 430829
מושך מיקרופיפטה בוער/חום	סאטר אינסטרומנטס	חתול# P-97
מלקחיים, דומונט מס' 3	כלים מדעיים משובחים	חתול# 11231-30
מלקחיים, דומונט מס' 5	כלים מדעיים משובחים	חתול# 11255-20
מלקחיים, דומונט מס' 55	כלים מדעיים משובחים	חתול# 11252-20
בלוק חימום	לאבטק הבינלאומי	חתול # דרי לחסום Digi2
מיקרוסקופ פלואורסצנטי הפוך	זיס	חתול# אקסיוברט 200
מקור אור	אולימפוס	Cat# הדגשה 3100
וסת לחץ ידני	מקמאסטר קאר	חתול# 0-60 PSI 41795K3
טיפים למיקרו-מעמיסים	אפנדורף	חתול# 5242956.003
מיקרו-בקר	ארדואינו	חתול# Arduino עקב
מצלמת מיקרוסקופ Hamamatsu Orca פלאש 4.0 V3
שלב ממונע XY למיקרוסקופ
פיפטות פסטר, פלסטיק
צלחת פטרי, 60X15 מ"מ	גריינר	חתול# 628102
צלחת פטרי, 35X10 מ"מ	אנונימי	חתול# 153066
צלחת פטרי, 34X14 מ"מ, כולל זכוכית כיסוי מיקרווול מס' 1.5	מאטק	Cat# P35G-1.5-14-C
מחזיק פיפטה	וורנר אינסטרומנטס	חתול# 64-2354 MP-s12u
פיפטה וטיפים
חוט להט מושך, חוט להט קופסה מרובע 3.0 מ"מ	סאטר אינסטרומנט	חתול# FB330B
קופסת דגירה לתרבית פרוסה	MPI-CBG	Cat# בהתאמה אישית
שסתום סולנואיד	חתול# LHDA053321H-A
צנטריפוגה שולחנית	הראיוס	חתול# 5431622
המדחום
מניפולטור תלת צירי	Sensapex Inc	Cat# ציר עץ uMP
ויברטומה	לייקה	Cat# VT1000s
אינקובטור שלם-עובר-תרבית-מערכת	חברת איקמוטו	חתול# RKI-10-0310
אמבט מים
תוכנה ואלגוריתמים
ארדואינו	ארדואינו
פיג׳י	RRID: SCR_002285
פיתון	בסיס Python Software	פייתון 2.7.12
זן		RRID: SCR_013672