אינטראקציה הידרופילית כרומטוגרפיה נוזלית: טכניקה להפרדת אנליטים קוטביים הידרופיליים באמצעות חרוזים הידרופיליים

תקציר

מקור: Liu, D., et al. Immunoglobulin G N-Glycan Analysis by Ultra-Performance Liquid Chromatography. J. Vis. Exp. (2020).

סרטון זה מדגים את עקרון ההפרדה של תרכובות קוטביות הידרופיליות באמצעות כרומטוגרפיה נוזלית של אינטראקציה הידרופילית. טכניקה זו מסייעת בטיהור של אנליטים קוטביים שונים, כולל N-גליקנים.

פרוטוקול

1. כרומטוגרפיה של אינטראקציה הידרופילית וניתוח גליקנים

1. מיזוג מכשירי UPLC והכנת שלבים ניידים
   1. הכן שלבים ניידים כולל ממס A: 100 mM אמוניום פורמט (pH = 4.4), ממס B: 100% acetonitrile, ממס C: 90% מים טהורים במיוחד (10% מתנול), וממס D: 50% מתנול (מים טהורים במיוחד).
   2. פתח את התוכנה כדי לשלוט בשלבים הניידים.
   3. יש לשטוף מכשירי UPLC בקצב זרימה של 0.2 מ"ל/דקה (50% ממס B ו-50% ממס C) למשך 30 דקות, ולאחר מכן בקצב זרימה של 0.2 מ"ל/דקה (25% ממס A ו-75% ממס B) למשך 20 דקות, ולאחר מכן איזון קצב זרימה של 0.4 מ"ל/דקה.
2. יש להמיס את ה-N-גליקנים המסומנים מראש עם 2-aminobenzamide (2-AB) ב-25 μL של תערובת של 100% אצטוניטריל ומים טהורים במיוחד ביחס של 2:1 (v/v). לאחר מכן, צנטריפוגה ב 134 × גרם במשך 5 דקות (4 ° C) ולטעון 10 μL של N-גליקנים מסומן לתוך מכשירי UPLC.
3. יש להפריד את ה-N-גליקנים המסומנים בקצב זרימה של 0.4 מ"ל/דקה עם שיפוע ליניארי של 75% עד 62% אצטוניטריל למשך 25 דקות. לאחר מכן, בצע הפעלה אנליטית על ידי סולם כיול דקסטרן / עמודת גליקופפטיד על UPLC ב 60 ° C (כאן, הדגימות נשמרו ב 4 ° C לפני ההזרקה).
4. זיהוי פלואורסצנטיות N-גליקן באורכי גל עירור ופליטה של 330 ננומטר ו-420 ננומטר, בהתאמה.
5. שלב את הגליקנים בהתבסס על מיקום שיא וזמן שמירה.
6. חשב את הערך היחסי של כל פסגת גליקן (GP)/ כל פסגות גליקן (GPs) (אחוזים, %) באופן הבא: GP1: GP1/GPs*100, GP2: GP2/GPs*100, GP3: GP3/GPs*100 וכו'.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
2-אמינובנזמיד, 2-AB	Sigma, סין
אצטוניטריל	Huihai Keyi טכנולוגיה ושות', בע מ, סין
פורמט אמוניום	בייג'ינג Minruida טכנולוגיה ושות', בע מ
סולם כיול דקסטרן/עמוד גליקופפטיד	וואטס טכנולוגיה ושות', בע מ, סין
העצמה 3.0	ווטרס טכנולוגיה ושות', בע מ, אמריקה
ערכת תיוג GlycoProfile 2-AB	Sigma, סין
מתנול	Huihai Keyi טכנולוגיה ושות', בע מ, סין
מד מים טהורים מילי-קיו	Millipore ושות', בע מ, אמריקה	202-2AB
העברת אקדח נוזלי	Smer נפל מדע וטכנולוגיה ושות', בע"מ, סין	יתרון A10
מקרר בטמפרטורה נמוכה במיוחד	Thermo ושות', בע מ, אמריקה	PB-10
כרומטוגרפיה נוזלית בעלת ביצועים גבוהים במיוחד	וואטס טכנולוגיה ושות', בע מ, סין
משאבת ואקום	וואטס טכנולוגיה ושות', בע מ, סין	4672100, 0.5-10μl & 10-100μl & 20-200μl &; 1000μl