כרומטוגרפיה נוזלית בעלת ביצועים גבוהים בשלב ההפוך: שיטה חזקה לכימות של חומצות סיאליות עם תווית פלואורסצנטית ופירוק שבודדו מכבד עכבר

Abstract

מקור: Cao, C. et al. קביעת חומצות סיאליות בדגימות כבד וחלב של עכברי בר ועכברי CMAH.J. Vis. Exp.(2017)

בסרטון זה, אנו מדגימים זיהוי של חומצות סיאליות, חומצה N-אצטיל-נוירמינית וחומצה N-גליקולילינוירמינית, באמצעות כרומטוגרפיה נוזלית בעלת ביצועים גבוהים, HPLC, לאחר דה-ריווטציה עם מגיב תיוג פלואורסצנטי מתאים כדי לסייע בזיהוי פלואורסצנטי.

Protocol

1. דריבטיזציה פלואורסצנטית של חומצות סיאליות

1. הכן 10 מ"ל של תמיסת OPD, המורכבת מ 100 מ"ג של o-phenylenediamine ו 208 מ"ג של נתרן מימן סולפיט ב 10 מ"ל של H₂O מזוקק.
2. הוסף 20 μL של תמיסת OPD לדגימות חומצה סיאלית. מערבלים במרץ במשך 30 שניות ודוגרים על דגימות במשך 4 שעות ב 80 מעלות צלזיוס בחושך (כלומר, לעטוף את המיקרו-צינורות ברדיד אלומיניום).
3. תנו לדגימות להתקרר למשך 5 דקות, הוסיפו 80 μL של H₂O מזוקק וצנטריפוגו את הצינורות במהירות של 14,000 x גרם למשך דקה אחת.
4. מעבירים 80 μL מהסופרנאטנט לבקבוקון HPLC בעל התאוששות גבוהה של 300 μL. דגימות חומצה סיאלית derivatized ניתן לאחסן ב 4-6 ° C עד שבוע אחד.

2. ניתוח HPLC של נגזרות חומצה סיאלית

1. נתח את הדגימות באמצעות מערכת HPLC סטנדרטית המחוברת לגלאי פלואורסצנטי מקוון.
2. השתמש בטור C18 בפאזה הפוכה עם המידות הסטנדרטיות של אורך 250 מ"מ וקוטר 4.6 מ"מ לצורך הניתוח.
3. הכן ממס A על ידי דילול 200 מ"ל של תמיסת מלאי עם 800 מ"ל של מים ברמה LCMS (LCMS - כרומטוגרפיה נוזלית ספקטרומטריית מסה). פתרון המניות עצמו יכול להיות מוכן כדלקמן:
   1. הוסף 46 גרם של חומצה פורמית ל 800 מ"ל של H₂O בדרגת LCMS.
   2. כוונן את ה- pH ל- 4.5 על ידי הוספת תמיסת אמוניום הידרוקסיד (puriss. p.a).
   3. העבירו את הממס לגליל מדידה ומלאו עד 1,000 מ"ל ב-H₂O ברמת LCMS. פתרון מלאי זה ניתן לאחסן ב 4-6 ° C עד 3 חודשים.
4. עבור ממס B, השתמש אצטוניטריל כיתה LCMS.
5. יש להפריד את נגזרות החומצות הסיאליות בקצב זרימה של 1 מ"ל/דקה באמצעות ההדבקה ההדרגתית הבאה:
   1. התחל על ידי הוספת 10% של ממס B מעורבב לממס A.
   2. מ 0 דקות עד 15 דקות, בהדרגה להגדיל את החלק היחסי של ממס B עם שיפוע ליניארי ל 60%.
   3. מ 15 דקות עד 16 דקות, במהירות להגדיל את החלק של ממס B עם שיפוע ליניארי מ 60% ל 90%. פעולה זו יוזמת את שטיפת עמוד HPLC.
   4. כדי להמשיך לשטוף את עמודת HPLC, שמור על רמת ממס B על 90% בין 16 דקות ל -18 דקות לפני שתפחית בהדרגה את רמת ממס B שוב ל -10% בין 18 דקות ל -19 דקות.
   5. שיווי מחדש של עמודת HPLC לתנאי התחלה של 10% B בין 19 ל-24 דקות.
6. הזריקו 50 μL של דגימה למערכת HPLC.
7. נטרו אלואנטים באמצעות אורכי גל עירור/פליטה של גלאי פלואורסצנטי של 373/448 ננומטר, וניתן לצפות לחומצות סיאליות מפורקות בזמני שימור משוערים של 9 דקות (עבור Neu5Gc-OPD) ו-10 דקות (עבור Neu5Ac-OPD).
8. חשב את הכמות היחסית של Neu5Gc (F_Neu5Gc) מאזורי שיא הפלואורסצנטיות של Neu5Ac (A_Neu5Ac) ו- Neu5Gc (A_Neu5Gc) כדלקמן:
   F_Neu5Gc [%] = 100×A_Neu5Gc/(A_Neu5Ac+A_Neu5Gc). במקרה של דגימות חלב וכבד מעכבר Cmah הומוזיגוטי F_Neu5Gc צריך להיות 0%, בעוד הערכים עבור F_Neu5Gc של עכברים הטרוזיגוטיים ועכברים מסוג בר עשויים להשתנות במידה רבה בהתאם לגיל העכבר וסוג הרקמה (בין 2% ל ->90%) עם שולי שגיאה צפויים של ±12%.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
כימיקלים
חומצה N-אצטיל-נוירמינית	סיגמא	A0812
N-glycolylneuraminic חומצה	סיגמא	50644	1 מ"ג aliquot צריך להיות מספיק
O-phenylenediamine	סיגמא	694975
נתרן מימן סולפיט	J&K סיינטיפיק בע"מ	75234
ניתוח HPLC
בקבוקון HPLC בעל התאוששות גבוהה	אג'ילנט טכנולוגיות	#5188-2788
מערכת HPLC	שימאדזו	נקסרה
גלאי פלואורסצנטי עבור HPLC	שימאדזו	RF-20Axs
עמודת HPLC	פנומנקס	Hyperclone ODS	250 x 4.6 מ"מ
רמת LCMS H2O	מרק מיליפור	#WX00011
אצטוניטריל ברמת LCMS	מרק מיליפור	#100029	היפרגרד
תמיסת אמוניום הידרוקסיד	פלוקה	#44273	פוריס. ע.א.