כל הנהלים הנוגעים למודלים של בעלי חיים נבדקו על ידי הוועדה המוסדית המקומית לטיפול בבעלי חיים ועל ידי ועדת הבדיקה הווטרינרית JoVE.
1. מדידת הנפח העוברי באמצעות תזוזת מים
הערה: בפרוטוקול זה משתמשים בעוברים של 24 שעות לאחר ההפריה (hpf) (איור 1). העוברים המשמשים במדידות הנפח אינם משמשים בניתוח אתנול.
- הניחו 10 עוברים ונוזל חוץ-עוברי בצינור מיקרוצנטריפוגה בנפח 1.5 מ"ל המסומן בנפח של 250 מיקרוליטר (איור 2A). הוסיפו מים לקו המילוי של 250 מיקרוליטר (ראו דגימה עם מים צבועים באיור 2B).
- חזור על שלב 1.1 כדי להגדיר כלי קיבול לעוברים שהוסרו מהם הכוריות.
- כדי להסיר את הכוריון, הניחו את העוברים בכוריון שלהם בצלחת פטרי 100 מ"מ עם 2 מ"ג/מ"ל קוקטייל פרוטאז במצע עוברי בטמפרטורת החדר (RT) למשך 10 דקות. כל כמה דקות, מערבלים בעדינות את העוברים כדי לשבור את הכוריון.
- לאחר שכל העוברים חופשיים מהכוריון שלהם, הוציאו את העוברים המפורקים מקוקטייל פרוטאז / מצע עובר והניחו בכלי פטרי חדש בקוטר 100 מ"מ עם מצע עובר טרי כדי לשטוף את העוברים. חזור על שלב זה של השטיפה פעם אחת נוספת (סה"כ 2 כביסות). מעבירים את העוברים לצלחת פטרי טרייה בקוטר 100 מ"מ.
- באמצעות הקצה הקטן ביותר האפשרי ומבלי לפגוע בעוברים, הסר בזהירות את כל הנוזלים מסביב לעוברים באמצעות מיקרופיפטור p200 (איור 2C) ושקול את המים עם משקל בדיוק של <0.1 מ"ג. כדי לקבוע את נפח הדגימה של 10 עוברים, יש להפחית את המשקל/נפח של המים (1 מ"ל מים = 1 גרם מים.) שהוסרו מ-250 מיקרוליטר. כדי לקבוע את נפחו של עובר יחיד, חלק את ההפרש בין 250 μL לבין משקל המים שהוסרו ב- 10.
2. טיפול בעוברים באתנול
- אספו עוברים ממיכלי הזדווגות והניחו בצלחת פטרי סטנדרטית בקוטר 100 מ"מ. יש לספור לא יותר מ-100 עוברים לצלחת פטרי בודדת ולדגור בטמפרטורה של 28.5°C.
הערה: אם רוצים להסיר את הכוריון (שלב 1.2), יש להסיר אותו לפני הוספת אתנול.
- ב 6 hpf, להוסיף עד 100 עוברים לצלחת פטרי סטנדרטית חדשה 100 מ"מ או עם מדיה עוברית או מדיה עוברית + 1% אתנול (v/v). מכסים, אך לא אוטמים את צלחת הפטרי. הניחו את העוברים באינקובטור בטמפרטורה נמוכה שנקבע על 28.5 מעלות צלזיוס למשך 18 שעות, או עד שהעוברים יגיעו לנקודת זמן התפתחותית של 24 hpf.
3. הכנת תהליך עבודה לפני עיבוד העוברים לכרומטוגרפיית גז חלל ראש
- הפוך תמיסה של 5 M NaCl במים (450 μL יהיה צורך לכל צינור דגימה) כדי denature כל החלבונים ולמנוע מטבוליזם אתנול. הכינו את קוקטייל הפרוטאז בריכוז של 2 מ"ג/מ"ל במדיה עוברית.
- תייגו צינור מיקרוצנטריפוגה בנפח 1.5 מ"ל ובקבוקון כרומטוגרף גז בנפח 2 מ"ל עבור כל דגימה. יש לסמן בקבוקונים נוספים של כרומטוגרף גז בנפח 2 מ"ל עבור תקני האתנול המתוארים להלן, כמו גם אוויר, מים וקוקטיילים ריקים של 5 M NaCl/פרוטאז.
- הגדר שלושה מיקרופיפטורים p200 שניים להגדיר 50 μL, והשלישי להגדיר 200 μL; מיקרופיפטור p1000 להגדיר 450 μL ו micropipettor p2 להגדיר 2 μL. עבור פיפטות הזכוכית המשמשות להעברת עוברים מצלחות פטרי לצינורות מיקרוצנטריפוגות של 1.5 מ"ל, העבירו במהירות את קצה הפיפטה דרך להבה כדי להחליק את הקצוות כדי לא לפגוע בעוברים בעת משיכתם לתוך הפיפטה.
4. עיבוד עוברים לכרומטוגרפיית גז חלל ראש
הערה: שני העוברים בכוריון שלהם ואלה שהוצאו בעבר מהכוריון שלהם מטופלים באופן זהה עבור עקביות בחישוב גורמי דילול.
- באמצעות שני מיקרופיפטורים p200 שנקבעו ל 50 μL, למשוך 50 μL של תמיסת קוקטייל פרוטאז לתוך אחד ולשאוב 50 μL של מים לתוך השני.
- בעזרת פיפטת הזכוכית והמיקרופיפטור, הניחו במהירות 10 עוברים (משלב 2.2) בצינור מיקרוצנטריפוגה בנפח 1.5 מ"ל וסגרו את הפקק (כפי שמתואר באיור 2A). חזור על כל הדגימות לבדיקה, בקרות ועוברים שטופלו באתנול.
- באמצעות מיקרופיפטור p200 המוגדר ל-200 μL, פתחו במהירות את הפקק והוציאו את כל שאריות המדיה העוברית (כמתואר באיור 2C). מניחים במהירות את פיפטה המכילה 50 μL מים בצינור במהירות אך בעדינות (כדי לא לפגוע בעוברים) להוסיף, ולאחר מכן להסיר את המים. הוסיפו במהירות 50 מיקרוליטר של תמיסת קוקטייל הפרוטאז מהפיפטור הממתין וסגרו את מכסה הצינור (איור 2D).
הערה: בצע תהליך זה דגימה אחת בכל פעם.
- תנו לדגימה לשבת ב-RT במשך 10 דקות כדי לאפשר לקוקטייל הפרוטאז לפרק את הכוריון. לאחר מכן, הוסיפו במהירות 450 μL של 5 M NaCl וסגרו את מכסה הצינור (איור 2E). מערבבים את הדגימות במשך 10 דקות. כדי לזרז את התהליך, הגדר את המיקסר כך שמערבל מספר דגימות בו זמנית.
הערה: הוסף כמות קטנה (~ 100 μL) של תערובת חרוזי סיליקה (2 גדלים, 0.5 מ"מ וחרוז 1 מ"מ) לכל צינור עם עוברים מעל 24 hpf. בעוברים ישנים יותר, הנוטוכורד יישאר שלם ללא קשר למשך הזמן שבו הם הומוגניים.
- לאחר הומוגניזציה במשך 10 דקות, להסיר במהירות 2 μL של עובר הומוגני supernatant ולהוסיף בקבוקון כרומטוגרף גז. לאטום במהירות את הבקבוקון עם כובע polytetrafluoroethylene .
5. הכנת תקני מדיה ואתנול
- כדי להכין את תקני המדיה, דללו את המדיה פי 10 עם תמיסת קוקטייל 5 M NaCl/פרוטאז. הוסף 2 μL מכל דגימה לבקבוקון כרומטוגרף גז ואטם עם מכסה polytetrafluoroethylene .
- כדי להכין את תקני האתנול, יש לבצע דילול סדרתי של 100% אתנול בתמיסת קוקטייל 5 M NaCl/פרוטאז לריכוזים הבאים: 0.3125, 0.625, 1.25, 2.5, 5, 10, 20 ו-40 מילימול. הוסף 2 μL מכל תקן לבקבוקון כרומטוגרף גז ואטם עם מכסה פוליטטרה-פלואוראתילן.
6. הכנת כרומטוגרפיית גז חלל הראש
הערה: כרומטוגרפיית גז חלל ראש משמשת לכימות רמות אתנול, לא להפרדה.
- כוונו את תנור החימום לדוגם האוטומטי ל-58°C והפעילו אותו. אפשר לתנור להגיע ל-58°C, והפעל את האוויר ואת קווי גז המימן המזינים את כרומטוגרף הגז (ליינון להבה המשמש לכימות האתנול).
הערה: יש להגדיר את ה- psi להפעלה נכונה של הכרומטוגרף בהתאם למפרט היצרן. ודא שקו ההליום מופעל ומכוון ל- psi המתאים.
- עבור המחיצה, יש לוודא שמספר הדגימות המוזרקות אינו >100. עבור סיב ההזרקה, ודא שמספר הדגימות המוזרקות אינו >500.
הערה: אם אחת מהן חורגת מכמות הזריקות, יהיה צורך לשנות אותן לפני הפעלת דגימות הבדיקה.
- הפעל את תוכנת הניתוח וודא שתחנת העבודה מוגדרת כראוי. אחסן את כל הנתונים בהתאם לתקני המעבדה/המחלקה. צור רשימה חדשה לדוגמה להפעלת הדוגמאות.
- הפעל את שיטת ההפעלה והמתן עד שגלאי יינון הלהבה יתייצב לפני הפעלת הדגימות. לאחר יציבות, הפעל את שיטת ההפעלה של התוכנה כדי לנקות את הסיבים.
7. מדידות לדוגמה באמצעות כרומטוגרפיית גז בחלל הראש
- לאחר השלמת שיטת ההפעלה, צור שורה חדשה אחת לכל דוגמה ברשימה לדוגמה. מתפריט השיטות בתוכנת הניתוח, עומס 436 זרם spme אתנול 2013 3min לספוג 2_5min rg לרוץ. METH עבור כל מדגם ברשימת המדגם.
- מלא את רשימת המדגם, החל מהאוויר, המים, 5 M NaCl / פרוטאז קוקטייל חסר. לאחר מכן הזן את התקנים לפי הסדר, מ 0.3125 ל 40 mM. עקבו אחר התקנים עם סיבוב שני של אוויר, מים ו-5M NaCl/פרוטאז קוקטיילים ריקים.
- הזן את כל דגימות העוברים ההומוגניים לבדיקה, מריכוז האתנול הנמוך ביותר לגבוה ביותר שנחזה. סיימו בכניסה לסבב שלישי ואחרון של אוויר, מים ו-5 M NaCl/פרוטאז קוקטייל חסר.
- הוסף את בקבוקוני כרומטוגרף הגז לדוגם האוטומטי לפי סדר הזנת הדגימות. אפשר לדגימות להתחמם במשך 10-15 דקות. הפעל את הריצות לדוגמה בתוכנה.
- לאחר הפעלת כל הדגימות והחסר הסופי, הפעל את שיטת הכיבוי בתוכנה על-ידי הוספת דוגמה סופית ברשימת הדגימות והפעלת מצב המתנה. מת'. גבה את כל הנתונים שנרכשו במהלך ריצות המדגם. כבה את הציוד בסדר הבא: מחמם autosampler, מיכל מימן, ורק לאחר טמפרטורת הכרומטוגרף מגיע 30 °C, מיכל האוויר. השאירו את מיכל ההליום דולק כדי לשמר את עמוד השעווה.
8. שילוב שיא אתנול לדוגמה וניתוח ריכוז דגימה
הערה: כל הערכים מ- 8.3 ואילך חושבו בקובץ Excel שכל המשוואות מילאו מראש.
- לאחר השלמת שיטת הכיבוי, לחץ על כרומטוגרמה פתוחה. פתח את התיקיה המכילה את התוצאות. דוגמאות משולבות באופן אוטומטי בתוכנית זו.
- בתוצאות, יש לוודא שהפסגות הנכונות שולבו (פסגות אתנול בין 2 ל-2.5). לאחר שכל הדגימות אושרו, הדפס או יצא את התוצאות.
- שרטט את גובה השיא של תקני אתנול על גרף. חשב את ערכי המדרון, יירוט Y ו- R2 עבור תקני אתנול (R2 צריך להיות >0.99).
הערה: ערכים אלה ישמשו לקביעת ריכוז האתנול מגובה שיא הדגימה.
- עבור כל דגימה, החסר את גובה השיא של הדגימה מיירוט Y של תקני אתנול. חלק ערך זה בשיפוע תקני האתנול כדי לקבל את ערך האתנול עבור כל דגימה בבקבוקוני GC.
- כדי לחשב את ריכוז האתנול בעוברים, תחילה חשב את גורם הדילול עבור כל דגימה. קח את מדידת הנפח המחושבת בשלב 1.3 של פרוטוקול זה וחלק אותה במדידת הנפח בתוספת 500 μL. זה מייצג את תמיסת קוקטייל 5 M NaCl/פרוטאז שנוספה לכל דגימה במהלך עיבוד העובר (שלבים 4.3 ו -4.4).
- באמצעות גורם דילול מדגם זה, להכפיל את ערך האתנול מדגם עבור כל דגימה. התוצאות יהיו בריכוז mM. חישוב דגימות ייחוס מדיה על ידי הכפלת ערך אתנול המדיה במקדם דילול של 10.
