אלקטרופורזה ג'ל פוליאקרילאמיד מקורי כחול: טכניקת הפרדה ללא דנטורינג לניתוח קומפלקסים שלמים של שרשרת הנשימה המיטוכונדריאלית

תקציר

מקור: Konovalova, S. ניתוח של קומפלקסים של שרשרת הנשימה המיטוכונדריאלית בתאים אנושיים בתרבית באמצעות אלקטרופורזה ג'ל פוליאקרילאמיד כחול מקורי ואימונובלוטינג. J. Vis. Exp. (2019)

בסרטון זה אנו מדגימים טכניקה אלקטרופורטית, הנקראת Blue native PAGE, לניתוח קומפלקסים של חלבוני נשימה מיטוכונדריאליים במצבם המקופל ופעיל מבחינה תפקודית. הצבע הכחול האניוני Coomassie גורם לקומפלקסים החלבוניים להיות טעונים שלילית, ומאפשר הפרדה על בסיס גודל ומבנה.

פרוטוקול

1. הכנת מאגרים ופתרונות

הערה: כל המאגרים והפתרונות המשמשים בפרוטוקול מסוכמים בטבלה 1. הנפחים הנתונים של המאגרים מספיקים כדי להכין ולהריץ 10 דגימות. ניתן לאחסן את כל המאגרים ב +4 ° C למשך עד שנה.

1. הכינו 20 מ"ל של חיץ ג'ל 3x המכיל 1.5 M חומצה אמינוקפרואית, 150 מ"מ Bis-tris במים מזוקקים (dH₂O). התאם את ה- pH ל- 7.0.
2. להכין 10 מ"ל של 2 M חומצה aminocaproic ב dH₂O.
3. הכן 1 מ"ל של המאגר המיטוכונדריאלי על ידי שילוב של הדברים הבאים: 0.5 מ"ל של חיץ ג'ל 3x, 0.5 מ"ל של 2 M חומצה אמינוקפרואית ו 4 μL של 500 mM EDTA.
4. הכינו 1,000 מ"ל של חיץ קתודה המכיל 15 מילימטר ביס-טריס ו-50 מ"מ טריצין ב-dH₂O. כוונן את ה-pH ל-7.0.
   1. הכינו 200 מ"ל של חיץ קתודה כחול על ידי הוספת 0.04 גרם של קומאסי כחול G-250 עד 200 מ"ל של חיץ קתודה.
5. הכינו 1,000 מ"ל של חיץ אנודה המכיל 50 mM Bis-tris ב-dH₂O. כוונן את ה-pH ל-7.0.
6. הכינו 2.5 מ"ל של מאגר דגימה המכיל 750 mM חומצה אמינוקפרואית ו-5% Coomassie blue G-250 ב-dH₂O.

2. הכנת ליזטים מיטוכונדריאליים

1. צלחת את התאים יום לפני האוסף. עבור תאי HEK293 או 143B, יש להשתמש בתווך הנשר המעובד של דולבקו (DMEM) עם 10% נסיוב בקר עוברי, 1% L-גלוטמין, 100 מ"ג/מ"ל פניצילין ו-100 מ"ג/מ"ל סטרפטומיצין. לגדל את התאים באינקובטור תרבית תאים ב +37 ° C באטמוספירה 5% CO₂ לח. ודא שיש לפחות 500,000 תאים עבור כל דגימה ביום האיסוף.
2. שטפו בעדינות את התאים פעם אחת עם PBS קר כקרח. הימנעו מניתוק התאים מהצלחת. לגרד את התאים ו pellet אותם ב 800 x גרם במשך 10 דקות ב +4 ° C.
3. שטפו את גלולת התא פעמיים עם PBS קר כקרח, וצנטריפוגה כמו בשלב 2.2. מדדו את ריכוז החלבון בשיטת ברדפורד באמצעות ערכה מסחרית. גלולה את התאים ב 800 x גרם במשך 10 דקות ב +4 ° C.
   הערה: לאחר איסוף התאים, בצע את כל השלבים ב +4 ° C ואל תתערבל.
4. הכן 20 מ"ל של PBS עם מעכב פרוטאז על ידי הוספת 200 μL של מעכב פרוטאז 100x ל 20 מ"ל של PBS. שמור על קרח. השהה מחדש את התאים ב- PBS עם מעכב פרוטאז לריכוז חלבון סופי של 5 מ"ג / מ"ל.
   1. כדי לחשב את נפח PBS עם מעכב פרוטאז הדרוש כדי להשעות מחדש את התאים ב 5 מ"ג / מ"ל, לחשב את כמות החלבון בכל דגימה. לצורך חישוב זה, השתמש בריכוז החלבון שנמדד בשלב 2.3 ובנפח PBS המשמש להשעיית התאים לאחר שטיפה בשלב 2.3.
5. הכן 1 מ"ל של 3.3 mM digitonin ב PBS עם מעכב פרוטאז. הוסף 3.3 mM digitonin לריכוז סופי של 1.65 mM. מערבבים היטב ודגרים על קרח במשך 5 דקות.
   1. כדי להכין 1 מ"ל של 3.3 מ"מ דיגיטונין ב-PBS עם מעכב פרוטאז, יש להמיס 4 מ"ג דיגיטונין ב-1 מ"ל PBS ב-100°C עד שלא נראה משקע וקריר על קרח באופן מיידי. הוסף 10 μL של מעכב פרוטאז 100x ל- 1 מ"ל של תמיסת דיגיטונין.
      הערה: השתמש רק בתמיסה טרייה של digitonin.
      זהירות: דיגיטונין הוא רעיל! השתמשו במסכת פנים, כפפות וחלוק מעבדה.
6. הוסף PBS עם מעכב פרוטאינאז (מוכן בשלב 2.4) לנפח הסופי של 1.5 מ"ל. צנטריפוגה ב 10,000 x גרם למשך 10 דקות ב +4 ° C. הסר את supernatant. בשלב זה, מיטוכונדריה הם pelleted.
7. יש להשהות מחדש את הגלולה המיטוכונדריאלית במאגר המיטוכונדריאלי. נפח המאגר המיטוכונדריאלי הוא מחצית מהנפח של PBS בשלב 2.4.
8. הכינו מלטוזיד טרי של 10% לאוריל ב-PBS המכיל מעכב פרוטאז (מוכן בשלב 2.4). 1 מ"ל מספיק עבור 10 דגימות. הוסף 10% לאוריל מלטוזיד לריכוז הסופי של 1%. לדגור על קרח במשך 15 דקות (שלב זה יכול להיות ארוך יותר עד כמה שעות).
9. צנטריפוגה ב 20,000 x גרם במשך 20 דקות ב +4 ° C. לאסוף את supernatant לתוך צינור חדש. למדוד את ריכוז החלבון בשיטת ברדפורד באמצעות ערכה. הוסף מאגר לדוגמה, נפח שהוא מחצית מהנפח של מלטוזיד לאוריל המשמש בשלב 2.8. ניתן לאחסן דגימות ב -80 °C למשך עד 6 חודשים.

3. הכנת ג'ל הדרגתי עבור BN-PAGE

1. יוצקים את ג'ל השיפוע עבור BN-PAGE בטמפרטורת החדר. הניחו את מכונת השיפוע על צלחת ערבוב וחברו אותה באמצעות צינורות גמישים למשאבה הפריסטלטית. חבר ערכת עירוי עם המחט לצינור. הכניסו מערבל מגנטי לתא הפרוקסימלי של יוצר השיפוע. שטפו את הצינור עם dH₂O במהירות משאבה מקסימלית למשך 10 דקות.
2. רוקנו את הצינור ואת יוצר השיפוע. השתמש בצינור כדי להסיר שאריות dH₂O בתעלה בין התאים של יוצר מעבר הצבע. סגור את התעלה ואת הצינור עם השסתום.
3. בעזרת מסגרת יציקה ומהדקים מרכיבים שתי פלטות זכוכית במחזיק, שיש לו חור בתחתית, ומניחים אותו על הדוכן. ודא שהוא פחות או יותר על משטח ישר עם מאזן מים. הניחו את המחט המחוברת לצינור בין לוחות הזכוכית.
4. הכינו תמיסות ג'ל 6% ו-15% (טבלה 2). שמור על קרח. הוסף אמוניום persulphate (APS) ו tetramethylenediamine (TEMED) (הם מתחילים פילמור) האחרון. מערבבים בעדינות כדי למנוע יצירת בועות אוויר.
5. העמיסו את הקצה הפרוקסימלי של תא הצינור ההדרגתי-ג'ל-מיקסר ב-6% ג'ל ואת הקצה הדיסטלי ב-15% ג'ל. הנפח הכולל של הג'ל צריך להיות שווה לנפח הג'ל המפריד בין צלחות הזכוכית. לכן, השתמש 2.6 מ"ל של 6% ג'ל ו 2.1 מ"ל של 15% ג'ל למערבל ג'ל הדרגתי עבור ג'ל אחד בגודל 8.3 ס"מ x 7.3 ס"מ.
6. הפעל את המערבל המגנטי, ופתח את הצינור והתעלה בין התאים של יוצר השיפוע. הפעל מיד את המשאבה הפריסטלטית ל- 5 מ"ל לדקה. מלאו את לוחות הזכוכית, ואל תאפשרו לבועות להיכנס לג'ל. הסר את המחט כאשר אין ג'ל בצינור.
7. כסו בעדינות את הג'ל עם dH₂O. שמרו את הג'ל בטמפרטורת החדר למשך שעה לפחות לצורך פילמור.
8. מיד לאחר מזיגת הג'ל, לשטוף את הצינור על ידי מילוי תאי שיפוע עם dH₂O באמצעות משאבה פריסטלטית במהירות מקסימלית. בעת הכנת שני ג'לים ויותר, תמיד לנקות את המערכת בין לבין.
9. הכן חיץ ג'ל 1x על ידי ערבוב 3 מ"ל של חיץ ג'ל 3x והוסף 6 מ"ל של dH₂O. הסר dH₂O מפני השטח של הג'ל עם נייר סינון בעדינות. שטפו את פני הג'ל עם חיץ ג'ל אחד. יש להסיר בעדינות את חיץ הג'ל הראשון עם נייר פילטר.
   1. הימנעו מהצטברות סיבים מנייר הסינון שעל הג'ל. כדי להבטיח זאת, לחתוך את הנייר לחתיכות קטנות עם מספריים, אבל לא לקרוע את הנייר.
10. הניחו את המסרק בין לוחות הזכוכית, אך אל תטבלו אותו במלואו כדי שתוכלו לשפוך את ג'ל הערימה מתחת למסרק. הכינו את ג'ל הערימה 4% (טבלה 2). הוסף APS ו- TEMED אחרונים כשהם מתחילים פילמור בקלות. יש לערבב בעדינות תוך הימנעות מבועות אוויר.
11. שכבו את ג'ל הערימה, הימנעו מבועות מתחת למסרק, וטבלו את המסרק במלואו. תנו לג'ל הערימה להתפלמר במשך 30 דקות לפחות. מוציאים את המסרק ושוטפים את הבארות עם חיץ ג'ל 1x באמצעות פיפט.
    1. לאחר פילמור, הג'ל יכול להיות מאוחסן ב +4 ° C במשך כמה ימים. כדי לאחסן את הג'ל, עטפו את הג'ל בנייר ספוג ב-dH₂O ובסרט פלסטיק כדי למנוע התייבשות של הג'ל.

4. אלקטרופורזה ג'ל מקורית כחולה

הערה: כדי למנוע התפרקות של קומפלקסים של OXPHOS, הפעל אלקטרופורזה ב +4 ° C. השתמש במאגרים מקוררים מראש.

1. מעמיסים את קסטת הג'ל בחיץ הקתודה הכחולה עד לתחתית הבארות. טעינת הדגימות קלה יותר כאשר הקלטת אינה מלאה למעלה. שטפו את הבארות עם החיץ הקתודה הכחולה ולאחר מכן מלאו את הבארות בחיץ הקתודה הכחולה באמצעות פיפט.
2. לטעון את הדגימות (5-30 מיקרוגרם של חלבון) לתוך בארות. ממלאים בעדינות את קסטת הג'ל עד למעלה עם חיץ הקתודה הכחולה ואת המיכל עם חיץ אנודה.
3. הפעל את הג'ל במשך 15 דקות במתח קבוע של 40 V. לאחר מכן להגדיל את המתח ל 80 V (או להשתמש זרם קבוע של 6 mA), לא יעלה על 10 mA. מעבירים את הג'ל עד שהצבע מגיע ל-2/3 מאורך הג'ל.
4. החליפו את החיץ הקתודה הכחולה בחיץ קתודה והמשיכו באלקטרופורזה עד שחזית הצבע נגמרת. בסך הכל, אלקטרופורזה לוקח בערך 3 שעות.
5. שלפו את לוחות הזכוכית והעבירו את החלבונים לקרום הפוליווינילידן פלואוריד (PVDF) על ידי כתם יבש למחצה.

תוצאות

טבלה 1: מאגרים ופתרונות המשמשים עבור BN-PAGE

חיץ או פתרון	הרכב	מתכון
3 x מאגר ג'ל	1.5 M חומצה aminocaproic	3.94 גרם של חומצה aminocaproic
	150 מ"מ ביס-טריס	0.63 גרם של Bis-tris
	dH2

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
לוחות תא 100 מ"מ	תרמו פישר סיינטיפיק	130182
40% אקרילאמיד/ביס 37.5:1	ביו-ראד	161-0148
חומצה אמינוקפרואית	סיגמא	A2504
אמוניום פרסולפט	סיגמא	A3678
ביס-טריס	סיגמא	B7535
ערכת בדיקת חלבון ברדפורד	BioRad	5000006
מגרדי תאים	פישר	11597692
קומאסי כחול G250 (סרווה כחול G)	סרווה	35050
דיגיטונין	סיגמא	D141
DMEM	לונזה	12-614פ/12
EDTA	לייף טכנולוגיות	15575-038
פ.ב.ס.	לייף טכנולוגיות	10270106
סרום בקר עוברי	לייף טכנולוגיות	10270106
גליצרול	סיגמא	G5516
יוצר מעברי צבע	ביו-ראד	1654120
לאוריל מלטוזיד (n-דודציל β-D-מלטוזיד)	סיגמא	D4641
ל-גלוטמין	לייף טכנולוגיות	25030024
ל-גלוטמין	גיבקו	25030
N,N,N′,N′-TETRAMETHYLETHYLENEDIAMINE (TEMED)	סיגמא	T9281
PBS	לייף טכנולוגיות	BE17-516F
פניצילין/סטרפטומיצין	לונזה	17-602E
פניצילין/סטרפטומיצין	גיבקו	15140
ספק כוח	GE שירותי בריאות	רווח למניה 301
מעכבי פרוטאז	תרמו סיינטיפיק	10137963
טראנס-בלוט טורבו מיני PVDF	BioRad	1704156
טריצין	סיגמא	T9784
טריפסין-EDTA	גיבקו	15400054
מנגנון אלקטרופורזה אנכי	BioRad	1658004