$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
1. פונקציונליות של המערך עם נוגדן biotinylated
- הכן את הפתרונות הבאים.
- T50 Buffer, תמיסה של 10 mM Tris-HCl (pH 8.0) ו- 50 mM NaCl. הפתרון יציב למשך חודש אחד ב- RT.
- T50-BSA על ידי תוספת T50 חוצץ עם 0.1 מ"ג/מ"ל של BSA. שמור את הפתרון מוכן על קרח.
- 10 מ"ג/מ"ל נתרן בורוהידריד (NaBH4) ב-1x PBS. הכינו את המוצר מיד לפני השימוש.
- 0.2 מ"ג/מ"ל של NeutrAvidin (ראה טבלת חומרים) במאגר T50.
זהירות: NaBH4 הוא חומר מחזר והוא דליק. יש לטהר תמיד את המיכל בגז חנקן לאחר השימוש ולאחסן אותו במייבש.
- לתפקד את המערך עם נוגדן biotinylated.
- הסר את המערכים הפונקציונליים של PEG-ביוטין מהמקפיא ואזן את הצינור החרוטי ל- RT לפני הפתיחה. הניחו את הכיסוי כשהמערך מכוון כלפי מעלה על צלחת תרבית רקמה 100 מ"מ מרופדת בסרט איטום (TC100).
הערה: צמצם את התאורה העילית. כל הפתרונות צריכים "לחרוז" על הריבועים שהוגדרו על ידי המערך ההידרופובי. הוסף נפח מתאים של תמיסה כדי לכסות לחלוטין כל ריבוע (בדרך כלל 10-15 μL) ולא לאפשר לנוזל לעלות על גדותיו של החלל המוגדר. כדי להסיר נוזלים במהירות, השתמשו בקו ואקום פנימי המחובר לבקבוק ואקום כדי ללכוד פסולת. יש לאפשר ל-NaBH4 להתפרק למשך שעה אחת לפני הסילוק על ידי השארת הצינור פתוח במכסה האדים הכימי. טיפול NaBH4 נחוץ כדי להפחית את האוטופלואורסצנטיות ברקע, ובכך להפחית זיהוי חיובי כוזב של מולקולה אחת.
- טפל בכל ריבוע של המערך עם 10 מ"ג / מ"ל של NaBH4 ב 1x PBS במשך 4 דקות ב RT. לשטוף שלוש פעמים עם PBS.
- לדגור על כל ריבוע במשך 5 דקות עם 0.2 מ"ג / מ"ל של NeutrAvidin ב T50. יש לשטוף שלוש פעמים עם T50-BSA.
הערה: NeutrAvidin נקשר ל-PEG-biotin ומספק אתר קישור לנוגדנים ביוטינילטים.
- לדגור על כל ריבוע במשך 10 דקות עם 2 מיקרוגרם/מ"ל של נוגדן ספציפי ל-POI ביוטינילציה ב-T50-BSA; לשטוף שלוש פעמים עם T50-BSA.
הערה: הפרוטוקול הנוכחי משתמש ב-biotinylated anti-EGFR IgG (ראה טבלת חומרים) כדי ללכוד EGFR-GFP.
2. SiMPull של POI מליזטים של תאים שלמים
הערה: הניחו את צלחת TC100 של מערכי SiMPull פונקציונליים על קרח למשך שארית הכנת SiMPull. שלב זה הוא משיכת נקודת עניין מחלבון ליזט כולל. אין לעשות שימוש חוזר בליזט לאחר ההפשרה.
- הכן את הפתרונות הבאים.
- הכינו 4% פרפורמאלדהיד (PFA)/0.1% גלוטראלדהיד (GA) ב-1x PBS.
זהירות: PFA ו-GA הם חומרים כימיים רעילים ומסרטנים פוטנציאליים. ללבוש PPE. יש להשליך את הכימיקלים כפסולת מסוכנת בהתאם לתקנות ולהנחיות המקומיות.
- הכן 10 mM Tris-HCl, pH 7.4.
- הפשירו וערבבו את הליזט על ידי פיטום עדין למעלה ולמטה. שמור על קרח.
- לדלל 1 μL של lysate לתוך 100 μL קר כקרח T50-BSA/PPI.
הערה: במידת הצורך, לקבוע את גורם הדילול המתאים של סך החלבון ליזט על ידי החלת מגוון של דילולים על המערך. הצפיפות האופטימלית של קולטני SiMPull לכל שטח מערך היא 0.04-0.08/μm2.
- יש לדגור על הליזט במערך במשך 10 דקות; ולאחר מכן לשטוף ארבע פעמים עם T50-BSA/PPI קר כקרח.
- לדלל נוגדן אנטי-פוספוטירוזין מצומד AF647 (ראה טבלת חומרים) ב-T50-BSA/PPI קר כקרח ולדגור על המערך למשך 1 שעות
הערה: בפרוטוקול הנוכחי, PAN anti-pTyr (PY99)-AF647 IgG משמש לזיהוי אוכלוסיית הזרחן של EGFR-GFP. השימוש בנוגדנים המסומנים ישירות מסיר את הצורך בנוגדנים משניים, מגדיל את אפשרויות התיוג ומשפר את עקביות התוצאות. ניתן להשיג נוגדנים בעלי תווית פלואורסצנטית ממקורות מסחריים. אם הנוגדנים אינם זמינים מסחרית, ניתן לתייג נוגדנים בהתאמה אישית באמצעות טכניקות ביו-צימוד סטנדרטיות, וערכות ביו-צימוד מסחריות זמינות. כל אצווה של נוגדנים המסומנים באופן פלואורסצנטי צריכה להיבדק לתנאי תיוג אופטימליים על ידי ביצוע SiMPull כדי למדוד עקומת מינון ולמצוא את נקודת הרוויה.
- יש לשטוף שש פעמים עם T50-BSA קר כקרח למשך 6-8 דקות בסך הכל.
- יש לשטוף פעמיים עם 1x PBS קר כקרח.
- יש לדגור על המערך עם תמיסת 4% PFA/0.1% GA למשך 10 דקות כדי למנוע דיסוציאציה של נוגדנים.
- יש לשטוף פעמיים במשך 5 דקות כל אחד עם 10 mM Tris-HCl, pH 7.4/PBS כדי להשבית את fixatives.
הערה: עבור ניסויים המשתמשים ביותר מנוגדן אחד, (למשל, זיהוי אתרי פוספוטירוזין מרובים), חזור על שלבים 2.5-2.9.
3. רכישת תמונות
הערה: רכישת תמונה של מולקולה בודדת מתבצעת באמצעות מטרת TIRF של 150x ומפצל תמונה הלוכד כל ערוץ ספקטרלי ברביע מסוים של מצלמת emCCD (ראה טבלת חומרים). תמונות כיול נרכשות לראשונה כדי לאפשר רישום ערוצים וכיול רווחי מצלמה באמצעות רשת יישור ערוצים ננו-דוגמנית (nanogrid) המכילה 20 x 20 מערכים של 200 ± 50 ננומטר חורים במרחק תוך חור של 3 ± 1 מיקרומטר (גודל כולל ~ 60 מיקרומטר × 60 מיקרומטר).
- בצע רישום ערוץ לפי השלבים הבאים.
הערה: רישום ערוץ מדויק נדרש כדי לחשב כראוי את colocalization של פולטים. צעד זה הוא קריטי.
- נקו את מטרת השמן והפקידו טיפת שמן על המטרה. מקם את הננו-גריד על הבמה לצורך הדמיה. באמצעות האור הלבן המשודר, התמקד בתבנית הרשת.
הערה: תמונות עם ננוגריד נרכשות באמצעות אור משודר, אשר עובר דרך ננו-גריד ומתגלה בכל הערוצים הספקטרליים. לחילופין, ניתן להשתמש בחרוזים רב-פלואורסצנטיים הפולטים פלואורסצנטיות המזוהה בכל ערוץ. רכישת התמונה תצטרך להיות אופטימלית בהתאם לכל מערך מיקרוסקופ.
- רכוש סדרה של 20 תמונות של הרשת. ודא שהפיקסלים אינם רוויים. שמור את סדרת התמונות כ"Fiducial".
- מקדו את ננו-הרשת כדי ליצור תבנית אוורירית. רכשו סדרה של 20 תמונות לצורך כיול הגבה. שמור את התמונה בשם "רווח".
- השג סדרה של 20 תמונות להסטת המצלמה על-ידי חסימת כל האור מלהגיע למצלמה. שמור את התמונה כ"רקע".
- רכוש SiMPull images.
הערה: לפני הדמיה של מערך ההחלקה, החלף את פתרון Tris עבור T50-BSA ואזן את המערך ל- RT.
- נקו את מטרת השמן והפקידו שמן נוסף על המטרה. אבטחו את מערך הכיסוי על במת המיקרוסקופ.
- מטב את עוצמת העירור של כל פלואורופור, זווית TIRF וזמן שילוב המצלמה. המטרה היא להשיג את האות לרעש הגבוה ביותר תוך מזעור ההלבנה של הדגימה. רשום את עוצמת הלייזר לקבלת עקביות במדידות עתידיות.
הערה: במחקר הנוכחי נעשה שימוש בזמן חשיפה של 300 מילישניות עבור הערוץ האדום הרחוק ו-1 שניות עבור הערוץ הירוק. הלייזר של 642 ננומטר שימש בעוצמת לייזר של כ-500 מיקרוואט, ואילו הלייזר של 488 ננומטר שימש בהספק של 860 מיקרוואט, שנמדד לפני עדשת הצינור.
- קבל תמונות עבור כל דגימה. דמיינו תחילה את הערוץ האדום הרחוק, ואחריו כל פלואורופור באורך גל נמוך יותר כדי להפחית את ההלבנה. בשל הנפח הנמוך המשמש לכל דגימה, בדוק את רמת החיץ כל 30-45 דקות וחדש לפי הצורך.