בדיקת דו-שכבתית ליפידית נתמכת מישורית: טכניקת מבחנה מבוססת מיקרוסקופיה לחקר הרכבת ספטין על חיקויי קרום ביולוגי

תקציר

מקור: Curtis, B. N. et al. הרכבה מחדש של אספת ספטין בממברנות לחקר תכונות ותפקודים ביופיזיקליים. J. Vis. Exp. (2022)

בסרטון זה, אנו מדגימים הליך לחקירת ארגון ספטין על שכבה דו-שכבתית ליפידית הנתמכת בזכוכית במבחנה באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי של השתקפות פנימית כוללת.

פרוטוקול

1. דו-שכבות שומנים מישוריות

1. ניקוי פלזמה של המגלשות
   הערה: ניקוי פלזמה מסיר מזהמים אורגניים ומגביר את ההידרופיליות של הזכוכית, מה שמבטיח ספיחת שומנים יעילה. השלבים הבאים עשויים להשתנות או שיש למטב אותם בהתאם למנקה הפלזמה ולכיסויי הזכוכית שבהם נעשה שימוש.
   1. לטהר את שואב הפלזמה במשך 5 דקות עם חמצן כדי להסיר אוויר מן הקווים ואת החדר. זאת על מנת להבטיח שכאשר מנקה הפלזמה מופעל, יש בעיקר חמצן בקווים ובתא, ומספק הכנות דו-שכבתיות עקביות יותר.
   2. בזמן הטיהור, הזרימו גז אינרטי, כגון N₂ או Ar, מעל זכוכית כיסוי המיקרו מחליקים כדי להסיר אבק וחלקיקים.
      אופציונלי: ניתן לשטוף מגלשות זכוכית על ידי ריסוס כל צד עם 100% איזופרופנול ואחריו מים. חזור על שטיפת המים איזופרופנול 3x ולאחר מכן יבש עם זרם N₂.
   3. סדרו את מגלשות הזכוכית בכיסוי יבש לתוך עריסת קרמיקה. הניחו את העריסה בחלק האחורי של תא הפלזמה כך שהכיסויים יהיו מקבילים לקצה הארוך של החדר (זה שומר אותם במקומם במהלך ניקוי פלזמה). הפעל את שואב הפלזמה למשך 15 דקות עם חמצן בעוצמה מרבית.
2. הכנה קאמרית
   הערה: השיטה המתוארת כאן משתמשת בתאים תוצרת בית מצינורות PCR מפלסטיק כדי לתמוך בנפחי התגובה, אך חומרים אחרים בעלי הדבקה נמוכה, כגון בארות סיליקון, עשויים גם הם להתאים.
   1. בעזרת סכין גילוח או מספריים, חתכו את הפקק ממש מתחת לחלק החלבי של צינור PCR בנפח 0.2 מ"ל (איור 1).
   2. צבעו את שפת צינור ה-PCR בדבק המופעל על ידי UV, תוך הימנעות מחלקו הפנימי של הצינור. הניחו בעדינות את דבק צינור ה-PCR במרכז כיסוי.
      הערה: כדי למנוע דבק בתוך התא, השתמש בכמות מינימלית של דבק כדי לקבל אטימה, ומיד לטפל עם UV מבלי להכות או להפריע את החדר.
   3. הניחו את התא תחת אור UV באורך גל ארוך למשך 5-7 דקות כדי לרפא את הדבק.
3. היווצרות דו-שכבתית
   הערה: יש להשתמש בשלב זה ברכבי שטח חד-שכבתיים ליצירת דו-שכבות יעילה. טבלה 1 מספקת מתכונים לכל המאגרים המשמשים בהיווצרות הדו-שכבתית, כולל מלאי וריכוזי חיץ סופיים.
   1. הוסף 40 μL של מאגר דו-שכבתי שומנים נתמך (SLBB: 300 mM KCl, 20 mM HEPES, pH 7.4, 1 mM MgCl₂; טבלה 1), 10 μL של 5 mM SUVs, ו 1 μL של 100 mM CaCl₂ לבאר. נערו בעדינות את התאים מצד לצד כדי לשבש את רכבי השטח, ולאחר מכן דגרו בטמפרטורה של 37°C למשך 20 דקות.
      הערה: כדי להגביל את האידוי, דוגרים בצלחת פטרי מכוסה עם מגבון לח.
4. שטיפת שומנים עודפים
   הערה: שלב זה מסיר עודפי רכבי שטח ומשמש כשלב החלפת חיץ. חשוב מאוד לא לגרד את bilayer עם קצה פיפטה בזמן שטיפה; אם הזכוכית נחשפת, ספטין וחלבונים רבים אחרים ייקשרו באופן בלתי הפיך, ויקטינו את ריכוז החלבון האפקטיבי.
   1. לאחר הדגירה, יש לשטוף את הדו-שכבה 6x עם 150 μL של SLBB, תוך פיטום למעלה ולמטה כדי לערבב בכל פעם תוך הימנעות מבועות.
      הערה: הוסף 150 μL ישירות ל-50 μL של חיץ ורכבי שטח שכבר קיימים עבור סך של 200 μL בבאר התגובה.
   2. כאשר אתם מוכנים להתחיל לדגור עם הספטינים או חלבון אחר לפי בחירתכם, שטפו את הדו-שכבה 6x עם 150 μL של חיץ תגובה (RXN: 33.3 mM KCl, 50 mM HEPES, pH 7.4, 1.4 mg/mL BSA, 0.14% methylcellulose, 1 mM BME).
      הערה: לקבלת התוצאות הטובות ביותר, הפוך את מאגר התגובה לרענן והיה זהיר מאוד בעת ערבוב התגובה היטב כדי למנוע בועות.
   3. בשלב השטיפה האחרון, הסר 125 μL של חיץ תגובה, משאיר 75 μL בבאר. הוסף 25 μL של ספטין מדולל במאגר אחסון ספטין (SSB: 300 mM KCl, 50 mM HEPES, pH 7.4, 1 mM BME) בריכוז הרצוי ותמונה על ידי מיקרוסקופ TIRF.
      הערה: בעת הגדרת בדיקה זו בפעם הראשונה או שילוב הרכב שומנים חדש, זה נוהג טוב כדי להבטיח שומנים מתפזרים בחופשיות על פני השטח באמצעות התאוששות פלואורסצנטית לאחר photobleaching (FRAP). בעוד קצב ההתאוששות יהיה שונה עבור הרכבי שומנים שונים ונמוך מטבעו מאשר עבור מערכות עצמאיות, השומנים לא צריכים להיות חסרי תנועה.

טבלה 1: רכיבי חיץ להכנת דו-שכבות שומנים נתמכות ותגובות. מוצגים נפחים של פתרונות מלאי המשולבים במאגרים והריכוזים הסופיים של כל רכיב. SLB ו-PRB ניתנים לאחסון בטמפרטורת החדר ולשימוש חוזר בין ניסויים. חיץ התגובה ו-SSB נעשים טריים עבור כל ניסוי.

מאגר דו-שכבתי שומנים נתמך (SLBB)
מניות	נפח	ריכוז סופי
2 מטר KCl	1.5 מ"ל	300 מ"מ
1 מטר HEPES	200 מיקרוליטר	20 מ"מ
500 mM MgCl2	20 מיקרוליטר	1 מ"מ
מים	8 מ"ל
Pre-Reaction Buffer (PRB)
מניות	נפח	ריכוז סופי
2 מטר KCl	166 מיקרוליטר	33.3 מ"מ
1 מטר HEPES	500 μL	50 מ"מ
מים	9.33 מ"ל
Reaction Buffer
מניות	נפח	ריכוז סופי
2 מטר KCl	166 מיקרוליטר	33.3 מ"מ
1 מטר HEPES	300 μL	50 מ"מ
10 מ"ג/מ"ל BSA	1.39 מ"ל	1.39 מ"ג/מ"ל
1% מתילצלולוז	1.39 מ"ל	0.0014
מים	עד 10 מ"ל
BME	0.7 מיקרוליטר	1 מ"מ
מאגר אחסון ספטין (SSB)
מניות	נפח	ריכוז סופי
2 מטר KCl	1.5 מ"ל	300 מ"מ
1 מטר HEPES	500 μL	50 מ"מ
מים	עד 10 מ"ל
BME	0.7 מיקרוליטר	1 מ"מ

תוצאות

איור 1: סכמטיות של הגדרת תא תגובה. כדי להכין תאים מותאמים אישית, צינור PCR 0.2 מ"ל נחתך במקום שבו הצינור מתחיל להתחדד ובמכסה (קווים מקווקווים אדומים). השפה הלא חתוכה של הצינור החתוך מצופה בשכבה דקה של דבק המופעל על ידי UV (כחול) ומונחת בדבק למטה על גבי כיסוי.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
0.2 מ"ל צינורות PCR עם מכסה שטוח, טבעי	ווטסון	137-211ג(EX)
HEPES	סיגמא אולדריץ'	H3375-1 ק"ג
מגנזיום כלורי	VWR	7791-18-6
מתיל צלולוז 4000cp	סיגמא-אולדריץ'	M052-100G
כיסויי מיקרוזכוכית לדו-שכבות מישוריות	מאטסונאמי	הופסק	22x22
דבק אופטי	נורלנד תורלאבס	נועה 68	דבק גמיש לזכוכית או פלסטיק
מנקה פלזמה	תחריט פלזמה	PE-25	מתח: 120V, 60Hz. זרם: 15 אמפר
אשלגן כלורי	VWR	0395-1 ק"ג
מנורת UV	ספקטרולין	ENF-260C	115 וולט, 60 הרץ, 0.20 אמפר
אלבומין בסרום בקר (BSA)	סיגמא-אולדריץ'	A4612-25G
בטא מרקפטואתנול (BME)	סיגמא-אולדריץ'	M6250-100ML
DOPC	אוונטי פולאר ליפידים	850375
ביצה ליס רודאמין PE	אוונטי פולאר ליפידים	810146