בדיקה דו-שכבתית ליפידית נתמכת כדורית: טכניקה לצפייה במכלול ספטין על מיקרוספרות

תקציר

מקור: Curtis, B. N. et al., Reconstitution of Septin Assembly at Membranes to Study Biophysical Properties and Functions. J. Vis. Exp. (2022).

סרטון זה מתאר את הטכניקה של חקר הרכבת חלבון ספטין על מיקרוספרות מצופות בדו-שכבות ליפידים. טכניקה זו מסייעת בהבנת המכלולים תלויי העקמומיות של חלבון על משטחים מעוקלים.

פרוטוקול

1. דו-שכבות שומנים נתמכות כדוריות

הערה: פרוטוקול זה משתמש במיקרוספרות סיליקה המרחפים במים אולטרה-טהורים בצפיפות של 10%. עבור כל עבודה על הפרמטרים הקינטיים של הרכבת חלבונים, חשוב לשלוט בקפידה על שטח הפנים הכולל של הממברנה בין ניסויים לעקמומיות. טבלה 1 מציגה את הנפחים המתוקנים של חרוזים וחיץ כדי לשמור על 5 מ"מ² משטח הפנים הכולל של הממברנה.

1. היווצרות דו-שכבתית
   הערה: באשר לדו-שכבות מישוריות, חשוב שיהיו רכבי שטח איכותיים להיווצרות דו-שכבתית חזקה. טבלה 1 מפרטת את נפח החרוזים מתמיסת צפיפות של 10% ואת נפחי SLBB המתאימים שלהם המשמשים לקבלת שטח פנים סופי של 5 מ"מ² עבור טווח של קוטר חרוזים.
   1. מיקרוספרות סיליקה (המכונות גם חרוזים) נוטות לשקוע ולהתגבש יחד; כדי לערבב את החרוזים ולפרק אשכולות כלשהם, מערבלים את הבקבוק במשך 15 שניות, ואז אמבט-סוניקציה למשך דקה אחת, ומערבלים שוב במשך 15 שניות.
   2. ערבב את נפח החרוזים המתאים (טבלה 1) עם הנפח המתאים של SLBB ו- 10 μL של רכבי שטח של 5 mM בצינור מיקרוצנטריפוגה בעל הדבקה נמוכה של 0.5 מ"ל.
   3. רוקנו את תערובת החרוזים-שומנים מקצה לקצה במשך שעה אחת בטמפרטורת החדר. ודא כי דגירה זו נעשית על מסובב כדי למנוע שיקוע.
2. הכנת תאים על PEGylated coverslips
   הערה: באשר לדו-שכבות מישוריות, תאים תוצרת בית מצינורות PCR מפלסטיק משמשים לתמיכה בנפחי התגובה, אך חומרים אחרים בעלי הדבקה נמוכה, כגון בארות סיליקון, עשויים לעבוד באותה מידה.
   1. בזמן שהחרוזים מתנדנדים, הפשירו כיסוי PEGylated בטמפרטורת החדר. חותכים צינור PCR של 0.2 מ"ל ומדביקים אותו לכיסוי כמתואר. עבור שקופיות בגודל 24 מ"מ x 50 מ"מ, ניתן להתאים עד 10 תאים לשקופית אחת.
      הערה: פרוטוקול זה משתמש בכיסויי זכוכית PEGylated בגודל 24 מ"מ x 50 מ"מ המוכנים מראש. בקצרה, כיסויי זכוכית מנוקים ביסודיות באמצעות סוניקציה באצטון, מתנול ו-3 M KOH. לאחר מכן הכיסויים מתפקדים עם n-2-aminoethyl-3-aminopropyltrimethoxysilane ומקושרים באופן קוולנטי ל-mPEG succinimidyl valerate. כיסויי PEGylated מוגמרים מאוחסנים אטומים בוואקום בטמפרטורה של -80°C. בעוד שכיסויי זכוכית PEGylated מוצעים כאן, אמצעים אחרים של פסיבציה, כגון BSA או שיטות פולי-L-ליזין, עשויים להיות יעילים.
3. שטיפת שומנים עודפים
   הערה: שלב זה נועד להסיר רכבי שטח עודפים ולבצע החלפת חיץ. חרוזים נשטפים 4x בסך הכל עם חיץ טרום תגובה (PRB: 33.3 mM KCl, 50 mM HEPES, pH 7.4). טבלה 2 מפרטת את מהירויות הסחיטה ב-RCF עבור טווח של קטרי חרוזים.
   1. סובבו חרוזים ב-RCF המיועד במשך 30 שניות (טבלה 2). אם אתם משתמשים במספר גדלי חרוזים, המשיכו להתנדנד בחרוזים עד שהגיע זמנם להישטף.
      הערה: לא כדאי לשקוע חרוזים גדולים יותר באותו סיבוב כמו חרוזים קטנים יותר עם מהירות שקיעת החרוזים הקטנה יותר כדי לחסוך זמן. זה יכול לגרום לחרוזים להידבק זה לזה ולפגוע בשלמות הדו-שכבתית.
   2. לאחר הסחרור הראשון, להסיר 50 μL של supernatant ולהוסיף 200 μL של PRB. לאחר הסיבובים השני והשלישי, להסיר 200 μL ולהוסיף 200 μL של PRB. לאחר הספין הרביעי, להסיר 200 μL ולהוסיף 220 μL של PRB. פיפטה במרץ לכל כביסה.
      הערה: נפח המתלים הסופי שונה מהשטיפות. אין לערבל את החרוזים לאחר הדגירה עם השומנים מכיוון שזה יכול להשאיר רווחים בדו-שכבות. כדי למנוע שקיעה בזמן עבודה עם גדלי החרוזים האחרים או הגדרת חלקים אחרים של הבדיקה, הניחו את תערובות החרוזים בחזרה על המסובב מקצה לקצה.
4. הכנת התגובה
   1. אם אתם מבצעים בדיקת תחרות עם מספר גדלי חרוזים, הכינו תערובת ביחס של 1:1 על ידי ערבוב נפחים שווים של כל גודל חרוז יחד. לאחר מכן, ערבבו 29 μL של תערובת החרוזים הרצויה (או של חרוז יחיד) עם 721 μL של מאגר RXN.
      הערה: חשוב לערבב היטב את החרוזים בכל שלב עם פיפטה כדי למנוע אשכולות צפופים של חרוזים; התוצאה תהיה פיזור חרוזים אחיד יותר ושטח פנים כולל מדויק.
   2. מערבבים 75 μL של חרוזים מדוללים ו 25 μL של חלבון מדולל SSB לבארות.
      הערה: המחברים בדרך כלל מדמיינים קומפלקסים של שמרים ב-1-50 ננומטר.
   3. אם מודדים ספטין במצב יציב, יש לדגור בטמפרטורת החדר למשך שעה אחת, ולאחר מכן לצלם באמצעות מיקרוסקופ קרוב ל-TIRF או קונפוקלי.
      הערה: תגובה זו נועדה לשמר את שטח הפנים הכולל של הממברנה של התגובה ב 5 מ"מ² ולייצר מצב תגובה סופי של 100 mM KCl, 50 mM HEPES, 1 mg/mL BSA, 0.1% methylcellulose, ו 1 mM BME.

טבלה 1: נפחים מנורמלים של מיקרוספרות. על מנת לשמור על שטח פנים שווה של כל גודל חרוז ולשמור על שטח הפנים הכולל של הממברנה עקבי בין הניסויים, חושבו נפחים עבור כל גודל חרוז וחיץ שנרמלו את שטח הפנים הכולל.

קוטר חרוז (μm)	נפח חרוזים מעורבים היטב (μL)	נפח מאגר SLB (μL)	נפח רכבי שטח (μL)
6.46	8.94	61.1	10
5.06	7	63	10
3.17	4.39	65.6	10
0.96	1.33	68.7	10
0.54	0.75	69.3	10
0.31	0.43	69.6	10

טבלה 2: מהירויות שיקוע עבור מיקרוספרות בקטרים משתנים. עבור כל קוטר חרוז, מהירויות השקיעה המינימליות המוצגות שימשו לפליטת החרוזים לשטיפת ליפוזומים לא קשורים

קוטר חרוז (μm)	מהירות שיקוע (RCF)
0.31	4.5
0.54	4.5
0.96	2.3
3.17	0.8
5.06	0.3

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
0.2 מ"ל צינורות PCR עם מכסה שטוח, טבעי	ווטסון	137-211ג(EX)
0.5 מ"ל צינורות הדבקה נמוכה	ארה"ב סיינטיפיק	1405-2600
בטא מרקפטואתנול (BME)	סיגמא-אולדריץ'	M6250-100ML
אלבומין בסרום בקר (BSA)	סיגמא-אולדריץ'	A4612-25G
זכוכית כיסוי להכנת כיסויים PEGylated	תרמו סיינטיפיק	152450	ריצ'רד-אלן מדעי SLIP-RITE כיסוי זכוכית 24x50 #1.5
DOPC	אוונטי פולאר ליפידים	850375
ביצה ליס רודאמין PE	אוונטי פולאר ליפידים	810146
HEPES	סיגמא אולדריץ'	H3375-1 ק"ג
מתיל צלולוז 4000cp	סיגמא-אולדריץ'	M052-100G
מיני צנטריפוגה
מיקרוספרות סיליקה לא פונקציונליות	Bangs Laboratories, Inc.	תלוי בגודל: SS0200*-SS0500*	סיליקה בתרחיף מימי
דבק אופטי	נורלנד תורלאבס	נועה 68	דבק גמיש לזכוכית או פלסטיק
אשלגן כלורי	VWR	0395-1 ק"ג
אמבט סוניקטור	ברנסון	1510R-MT	שואב אולטראסוני Bransonic. 50-60 הרץ. פלט: 70W
סויה PI	אוונטי פולאר ליפידים	840044
צנטריפוגה שולחנית	אפנדורף	22331
מנורת UV	ספקטרולין	ENF-260C	115 וולט, 60 הרץ, 0.20 אמפר