alamarBlue Assay: שיטה פלואורומטרית רגישה לסינון ההשפעות ציטוטוקסיות של פורמולציות דמעות מלאכותיות על הפעילות המטבולית של תאי אפיתל בקרנית אנושיים

תקציר

מקור: Rangarajan, R. et al. השפעת פורמולציות דמעות מלאכותיות על הפעילות המטבולית של תאי אפיתל בקרנית האנושית לאחר חשיפה לייבוש. J. Vis. Exp. (2020)

סרטון זה מתאר בדיקה פלואורומטרית במבחנה להערכת ההשפעות של פורמולציות דמעות מלאכותיות על הפעילות המטבולית התאית של תאי אפיתל בקרנית באמצעות תמיסת Alamar blue מבוססת רזזורין. נוסחה לא רעילה שומרת על התאים במצב בריא, פעיל מטבולית, מה שמקל על הפחתת resazurin לתוך resorufin פלואורסצנטי מאוד.

פרוטוקול

1. תרבית תאי אפיתל בקרנית האדם

1. גדל HCEC אלמותי בצלוחיות מצופות קולגן בגודל 75 סמ"ר עם 20 מ"ל של תערובת מדיום/מזין Eagle F-12 (DMEM/F12) של Dulbecco המכילה 10% נסיוב בקר עוברי (FBS) ו-1% פניצילין/סטרפטומיצין ב-37°C עם 5% CO₂.
   הערה: אין צורך בטלטול.
2. שנה את המדיה כל 2-3 ימים.

2. הכנת תאים לבדיקה

1. לאחר שהתאים כמעט נפגשים, הסר את מצע התרבית.
2. הוסף 4-6 מ"ל של תמיסת ניתוק תאים לכל בקבוק בגודל 75 סמ"ר. דוגרים על התאים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס עד שהתאים מתנתקים (כ-20-30 דקות), ובודקים תחת המיקרוסקופ מעת לעת.
3. הוסף 2-6 מ"ל DMEM/F12 המכיל 10% FBS לכל בקבוק בגודל 75 סמ"ר.
4. מעבירים את תכולת הבקבוק לצינור צנטריפוגה של 50 מ"ל.
5. צנטריפוגו את התאים במהירות 450-500 x גרם למשך 5 דקות. הוציאו את הסופרנאטנט והשהו מחדש את התאים במצע שחומם מראש.
6. לספור את התאים באמצעות hemocytometer. חשב את נפח המדיה המכיל סך של 1 x 10⁵ תאים.
7. הוסף 1 x 10⁵ תאים לכל באר של צלחת תרבית מצופה קולגן-1 48 בארות. הוסף מספיק מדיה לבאר כך שהנפח הסופי של המדיה בבאר הוא 0.5 מ"ל של תרבית DMEM/F12 עם 10% FBS.
   הערה: נוסחת דמעות מלאכותית עלולה לגרום ציטוטוקסיות שניתן למדוד על ידי ירידה בפעילות המטבולית של HCEC. עקביות הנתונים תלויה בהוספת אותו מספר HCEC לכל באר בעת הזריעה. ריכוז התרבית המומלץ עבור 48 צלחות באר הוא 1 x 10⁵. מכיוון שתאי יונקים יכולים להתיישב בצינור הצנטריפוגה לאחר השעיה מחדש, מומלץ להשהות מחדש את התאים על ידי תסיסה לעתים קרובות תוך כדי זריעת הלוחות עם תאים, כך שתרחיף התא יחולק באופן שווה עם HCEC.
8. לדגור על התאים ב 37 ° C ו 5% CO₂ במשך 24 שעות.

3. ללא פרוטוקול ייבוש

1. הליך בקרה
   1. לאחר הדגירה של 24 שעות, מוציאים את אמצעי התרבות מהצלחת.
   2. יש לטפל מיד עם 150 μL של פורמולציית בדיקה ותמיסת בקרת מדיה.
   3. יש לדגור על התאים בטמפרטורה של 37°C ו-5%_CO2 למשך 30 דקות.
   4. הסר את פתרונות הבדיקה מהתאים.
   5. הוסף 0.5 מ"ל של תמיסת צבע מטבולית 10% כדי לבדוק פעילות מטבולית. לדגור על התאים במשך 4 שעות נוספות ב 37 ° C ו 5% CO₂.
   6. לאחר תקופת הדגירה של 4 שעות, הסר 100 μL של תמיסת צבע מטבולית מכל באר ומניחים כל 100 μL לתוך באר של צלחת 96 באר.
   7. מדוד את הפלואורסצנטיות של כל באר באמצעות קורא לוחות פלואורסצנטי (טבלה של חומרים). הגדר את אורך גל העירור על 540 ננומטר ואת אורך גל הפליטה על 590 ננומטר.
2. ללא פרוטוקול ייבוש (הליך התאוששות)
   1. חזור על שלבים 3.1.1−3.1.4.
   2. הוסף 0.5 מ"ל של מדיה DMEM/F12 לכל באר.
   3. לדגור על קבוצה אחת של תרביות במשך 18 שעות ב 37 ° C ו 5% CO₂.
   4. הסר את המדיה והוסף 0.5 מ"ל של תמיסת צבע מטבולית 10%. חזור על שלבים 3.1.6 ו- 3.1.7.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
96 צלחת באר	כוכב משנה	3370
michal_1977	פישר סיינטיפיק	דאל 1025
קורנינג 48 צלחות באר	קורנינג	354505	זהו המותג BioCoat מצופה קולגן
DMEM/F12 עם L-גלוטמין ו-15 mM HEPES	גיבקו	11039-021	אין פנול אדום במדיה זו
סרום בקר עוברי	היקון	SH30396.03
תאי אפיתל של הקרנית האנושית	אוניברסיטת אוטווה	לא ישים	SV40-אימורטליזציה של תאי אפיתל קרנית אנושיים מד"ר מ. גריפית (מכון אוטווה לחקר העיניים, אוטווה, קנדה) ואופיינו Griffith M, Osborne R, Munger R, Xiong X, Doillon CJ, Laycock NL, Hakim M, Song Y, Watsky MA. מקבילות קרנית אנושיות פונקציונאליות הבנויות מקווי תאים. מדע. 1999; 286:2169–72.
TrypLE Express (תמיסת ניתוק תאים)	פישר סיינטיפיק	12605036
ציציה 5	ביוטק	CYT5MPV	יכול לקרוא פלואורסצנטיות מ 280 - 700 ננומטר (עבור בדיקה 540/590)