תגובת שרשרת דיגיטלית של פולימראז טיפתי לזיהוי מוטציות אינדל בגני מטרה

תקציר

מקור: Carballar-Lejarazú, R., et al. Digital-Droplet PCR כדי לזהות מוטציות Indels באוכלוסיות יתושים אנופלינים מהונדסים גנטית. J. Vis. Exp. (2021).

סרטון זה מדגים את תפקידה של תגובת שרשרת פולימראז טיפתית דיגיטלית בזיהוי מוטציה אינדל בדגימת DNA. הדיוק והרגישות הגבוהים של ddPCR מאפשרים זיהוי מדויק ועקבי של מוטציות נדירות הקיימות בדגימה, גם ברמות נמוכות. הוא יכול לזהות ולכמת מוטציות אינדל באזורים שונים של הגנום, ומספק תובנות חשובות על מנגנוני המוטציה וההשלכות התפקודיות של מוטציות אלה.

פרוטוקול

1. תגובות ddPCR והכנת יצירת טיפות

1. כימות DNA באמצעות fluorometer.
   הערה: עבור בדיקת הנטישה מומלץ להשתמש בטווח של 3,000-30,000 עותקי גנום הפלואידי לכל תגובה, אשר נועד לזהות אירועי NHEJ באמצעות בדיקת תיוג HEX, הנקשרת לרצף WT של אתר החיתוך הממוקד ולא תחנך (נשירה) אם יש מחיקה או הכנסה באתר היעד, המציין את נוכחותו של וריאנט NHEJ.
2. חשב את מספר העותק באמצעות משקל הגנום הפלואידי וריכוז ה- DNA בתמצית. זה נעשה על ידי הכפלת ריכוז הדנ"א המופק בנפח המשמש לקבלת מסת הדנ"א הכוללת, ולאחר מכן חלוקתו במשקל הגנום הפלואידי. ודא שהנפח שנוסף הוא בין 1-10 μL. לדלל לפי הצורך כדי להיות בטווח העתק הגנום הפלואידי המומלץ.
   הערה: גנום הפלואידי Anopheles gambiae אחד מוערך ב-0.27 pg לכל יתוש בוגר.
3. תכננו פריימרים ובדיקות. תכננו פריימרים אוליגונוקלאוטידים קדימה ואחורה עם טמפרטורת התכה ראשונית (Tm) בטווח של 55-60 מעלות צלזיוס המקיפים את הקצוות של 5 ו-3 אינץ' של אתר המטרה gRNA ומייצרים אמפליקון של 150-400 bp.
   1. בדיקת HEX (Hexachloro-fluorescein) לזיהוי NHEJ: תכנן אוליגונוקלאוטיד באורך ~15-20 bp המשלים לאתר היעד והוסף את הגשושית HEX-probe לקצה 5' ואת BHQ1 (BLack Hole Quencher 1) לקצה 3'. ה- Tm של בדיקת ההידרוליזה צריך להיות גבוה ב 3-10 מעלות צלזיוס מה- Tm של הפריימרים.
   2. FAM (6-carboxyfluorescein)-מסומן בדיקה להתייחסות WT: תכנן אוליגונוקלאוטיד ~ 15-20 bp באורך משלים לאתר גנום שמור מרוחק (כ -25 bp) מאתר היעד והוסף את הגשושית FAM לקצה 5'-end ואת BHQ1 לקצה 3'. ה- Tm של בדיקת ההידרוליזה צריך להיות גבוה ב 3-10 מעלות צלזיוס מה- Tm של הפריימרים.

2. הכנת תגובת PCR

1. הכן 25 μL של דגימת ddPCR ערבוב עם הרכיבים הבאים: ddPCR supermix עבור בדיקות (ללא UTP): 12.5 μL, פריימרים קדימה ואחורה (10 μM): 1 μL כל אחד, בדיקות HEX/FAM (10 μM): 0.625 μL כל אחד, DNA: 1-5 μL (3,750-37,500 עותקים גנום הפלואידים) ומים: עד 25 μL.
2. ערבבו היטב את התגובות על ידי מערבולות או ריפלוקס פיפטינג (למעלה ולמטה) (20x).
   הערה: אם התגובות הן בצלחת של 96 בארות, יש להקפיץ את כל הנפח למעלה ולמטה 20 פעמים במקום להסתחרר כדי למנוע היווצרות בועות.
3. צנטריפוגו בקצרה את הדגימות כדי ליישב את התערובת בתחתית הצינור או היטב.
   הערה: ודא שהתגובות הן בטמפרטורת החדר ליצירת הטיפות. הכינו 1x של תערובת ddPCR עבור בארות נוספות/שאינן בשימוש בכל מחסנית (בכל מחסנית יש 8 בארות).

3. יצירת טיפות

1. באמצעות פיפטה רב-ערוצית של 50 μL, טען 20 μL של תערובת דגימת ddPCR לשורה האמצעית של המחסנית (איור 1A, למעלה).
2. מעמיסים 70 μL של השמן לשורה התחתונה. טען 20 μL של 1x ddPCR supermix לתוך בארות שאינן בשימוש.
   הערה: אין להכניס בועות.
3. הניחו את האטם כשהוא נוגע רק בקצוות, והימנעו מהאזור הקעור המרכזי (איור 1B).
4. הניחו את הצלחת היטב במחולל הטיפות וסגרו את המכסה כדי להתחיל בריצה.
5. באמצעות פיפטה רב-ערוצית, העבירו 40 μL של תערובת האמרזיה מהשורה העליונה של המחסנית (איור 1A, למטה) לתוך לוח 96 הקידוחים.
   1. ציירו את דגימת הנוזל למשך 3-5 שניות בזווית של 45-30°. מוציאים את התערובת באיטיות ליותר מ-3 שניות בזווית של 45 מעלות לתוך דופן הבאר, ומאפשרים לה לטפטף בצד. זה בסדר ללכת לתחנה השנייה (גירוש מוחלט) של פיפטה כדי לגרש את כל הנוזלים.
6. בעזרת אטמי חום בנייר כסף, אטמו את הצלחות למשך 5 שניות בטמפרטורה של 180°C.

4. PCR

1. הכניסו את הצלחת האטומה לתרמוסייקלר (איור 1C) והגדירו את תנאי ה-PCR המומלצים אם אתם פועלים בהתאם להנחיות ההורדה של NHEJ באופן הבא:
   1. דנטורציה ראשונית ב 95 ° C למשך 10 דקות.
   2. הגדר 40 מחזורים של 94 ° C עבור 30 s כדי denature, 55 ° C עבור 1 דקה כדי anneal, ו 60 ° C עבור 2 דקות כדי להארכה.
   3. יש להחזיק בטמפרטורה של 98°C למשך 10 דקות.
   4. להחזיק בטמפרטורה של 4°C.
      הערה: ניתן למטב את טמפרטורת החישול של פריימרים וערכות בדיקה ספציפיים באמצעות שיפוע תרמי. השתמש בקצב רמפה של 2 ° C / s עבור כל השלבים. יש להתאים את תנאי ה-PCR בהתאם לכל תכנון ניסוי והגדרה.

5. קריאה טיפתית

1. הניחו את הצלחת בבטחה בקורא הטיפות עם באר A-1 בפינה השמאלית העליונה (פינה מוחלקת, שלושת האחרים עם שוליים) (איור 1D).
2. הגדר את הלוח בתוכנית: הגדרת FAM כערוץ הייחוס הידוע ו- HEX כערוץ הלא ידוע (איור 2A).
3. הפעל את ניסוי הקריאה Droplet ככימות ישיר. לאחר סיום הריצה, שנו את סוג הניסוי ל-Drop-Off (DOF) עבור הניתוח (איור 2A).

תוצאות

איור 1: מערך ונוהל ניסוי. (A) הכנת מחסנית ליצירת טיפות. (למעלה) דוגמאות מלאות בשורה האמצעית של המחסנית, בעוד שמן מלא בשורה התחתונה. (למטה) שורה עליונה מלאה בטיפות מתחלבות לאחר יצירת טיפות. (B) מחולל טיפות עם מחסנית מלאה בדגימה ומכוסה באטם במקום. (C) צלחת 96 בארות מכוסה באטם רדיד אלומיניום בתרמו-סייקר. (D) קורא טיפות עם לוח 96 בארות ב...

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
ריאגנטים
ddPCR Super Mix עבור בדיקות (ללא dUTP)	ביו-ראד	1863024
EDTA (pH 8.0)	Invitrogen	AM9260G
מים ברמת PCR			ניתן להשתמש בכל מים מאושרים בדרגת PCR
פרוטאינאז K 20 מ"ג/מ"ל	תרמו פישר סיינטיפיק	AM2546
חומרים
צלחת ddPCR 96-Well	ביו-ראד	12001925
מחולל טיפות DG8 מחסנית ואטמים	ביו-ראד	1864007
שמן דור טיפות לגשושיות	ביו-ראד	1863005
בדיקות פלואורסצנטיות (למשל בדיקות FAM/HEX)	סיגמא-אולדריץ'	לא ישים	גשושיות הן ספציפיות לניסוי וניתן לרכוש אותן מכל מוכר מוסמך זמין.
פריימרים אוליגונוקלאוטידים קדימה ואחורה	סיגמא-אולדריץ'	לא ישים	פריימרים הם ספציפיים לניסוי וניתן לרכוש אותם מכל מוכר מוסמך זמין.
ציוד
C1000 מגע מחזור תרמי	ביו-ראד	1851148	יכול להשתמש במחזור תרמי אחר עם פונקציית שיפוע ובאר עמוקה