תגובת שרשרת פולימראז הדרגתית לקביעת טמפרטורת החישול האופטימלית

תקציר

מקור: Tsujimoto, H. et al., Indel Detection בעקבות מוטגנזה CRISPR/Cas9 באמצעות ניתוח המסה ברזולוציה גבוהה ב- Mosquito Aedes aegypti. J. Vis. Exp. (2021).

סרטון זה מדגים את תגובת שרשרת פולימראז הדרגתי לאופטימיזציה של טמפרטורת החישול של פריימרים, הקובעת טמפרטורת חישול הדרגתית לאורך בארות. ההשפעה של טמפרטורות חישול שונות נקבעת על ידי התשואה של מוצרים מוגברים המסייעים לייעל את מצב התגובה.

פרוטוקול

1. סריקה לאיתור פולימורפיזמים של נוקלאוטידים בודדים (SNPs), תכנון פריימר HRMA ואימות פריימר

1. זיהוי SNP ביתושים מסוג מושבת מעבדה פראית
   1. בחר באקסון היעד כדי לשבש את תרגום הפוליפפטיד הנכון.
      הערה: המטרה צריכה להיות קרובה לקודון ההתחלה או בין שאריות המפתח הדרושות לתפקוד החלבון. ככל שהאקסון קצר יותר (למשל, ≤200 בסיסים), כך קשה יותר לכוון ולנתח אותו. הימנע מעריכה קרוב לגבולות של אקסון, מכיוון שהדבר מאלץ את אחד מפריימרים HRMA לחצות אינטרון או להיות באינטרון. זה לא רצוי מכיוון ששיעורי SNP נוטים להיות הרבה יותר גדולים באזורים אלה.
   2. עיצוב פריימר
      1. עבור אל אתר NCBI Blast - Primer Blast, העתק והדבק את האקסון שנבחר בתיבה בראש הדף | בחר את גודל המוצר PCR (ודא שהוא מקיף את רוב exon) | בחר את האורגניזם.
      2. לחץ על פרמטרים מתקדמים | בחר (עבור PCR Product Tm) והוסף 60 (לטמפרטורה מיטבית של 60° צלזיוס) | קבל פריימרים. שמור את שאר הפרמטרים כברירת מחדל.
   3. השגת DNA גנומי (gDNA) ממושבת מעבדה מסוג בר. הניחו בצד 10 יתושים, הרדימו אותם עם_CO2 והניחו אותם בצלוחית פטרי על קרח כדי לשמור עליהם לא פעילים. הגדר 10 צינורות המכילים 0.5 μL של מגיב לשחרור DNA מרקמה ו 20 μL של חיץ דילול, שניהם מסופקים בערכת שחרור DNA המוצע בטבלת החומרים.
   4. הסר רגל אחת מיתוש בודד באמצעות מלקחיים והנח אותה בצינור מתאים של תמיסה מדוללת של מגיב שחרור ה- DNA (משלב 1.1.3), תוך השקעת הרגל לחלוטין בתמיסה. חזור על שלב זה עם היתושים הנותרים, לנגב את המלקחיים עם 70% אתנול לפני שתמשיך לשלב הבא.
   5. יש לדגור על התמיסה המכילה את הרגליים בטמפרטורת החדר למשך 2-5 דקות, ולאחר מכן בטמפרטורה של 98°C למשך 2 דקות, ולאפשר לה להתקרר תוך הגדרת תגובת ה-PCR.
      הערה: לוחות המכילים את gDNA ששוחרר ניתן לאחסן ב -20 ° C, ואת הפרוטוקול ניתן להשהות בשלב זה.
   6. הכינו 10 צינורות המכילים 10 μL של 2x PCR Master Mix, פריימרים לריכוז סופי של 0.5 מיקרומטר, ומים ברמה מולקולרית לנפח סופי של 20 μL, והעבירו 1 μL של הדגימה המדוללת לכל צינור. בצע PCR בהתאם לפרמטרים הבאים של מחזור: 98 ° C 5 דקות, 40 מחזורים של 98 ° C במשך 5 שניות, 60 ° C 30 שניות, 72 ° C 20 שניות לקילו בייט; הארכה סופית של 72°C למשך דקה.
   7. לטהר את מוצרי ה-PCR עם אנזים כדי לפרק את שאריות הפריימרים ל-PCR ולנטרל דפוספורילט עודפי dNTP או כל ערכת ניקוי עמודות. המשך בריצוף הדגימות.
   8. נתח כל אלקטרופרוגרמה לנוכחות פסגות כפולות/בסיסים דו-משמעיים, והתאם קריאות בסיס באופן ידני בכל רצף באמצעות קוד הבסיס המנוון המתאים.
      הערה: שלב זה חייב להתבצע לפני יישור רצפים מרובים מכיוון שמקובל שתוכנת קריאת הבסיס בוחרת את הפסגה הבולטת יותר כקריאת הבסיס "האמיתית", מה שיוצר רושם מוטעה של היעדר SNPs.
   9. בצע יישור רצפים מרובים באמצעות תוכנת היישור, SeqMan Pro, המופיעה בטבלת החומרים או תוכנת יישור קוד פתוח אחרת, כגון ClustalW או T-Coffe.
      1. פתח את תוכנת היישור | לחץ על הוסף רצפים | בחר את הרצפים הרצויים ולחץ על הוסף | לאחר בחירת כל הרצפים, לחץ על סיום.
      2. לחץ על Assemble כדי לבצע את היישור. כדי לפתוח את היישור, לחץ על Contig 1 ונתח את היישור וזהה את SNPs (איור 1).
         הערה: כחלופה לשלבים 1.1.3-1.1.6, PCR יכול להתבצע מדנ"א גנומי מבודד המתקבל מדגימות בתפזורת (נגזר מ ->10 אנשים). ניתן לנתח אמפליקונים רצפים ישירות עבור נוכחות SNPs המופיעים כפסגות כפולות באלקטרופרוגרמה, אם כי SNPs נדירים יהיה קשה יותר לזהות.
   10. תכנן 3-5 רנ"א מנחה יחיד (sgRNAs), תוך הימנעות מאזורים המכילים SNP שזוהה לעיל, בהתאם לפרוטוקול המתואר ב.

2. עיצוב פריימר HRMA

1. בדוק את רצף האקסון עבור היווצרות אפשרית של מבנים משניים במהלך PCR באמצעות mFold.
   1. עבור אל שרת האינטרנט UNAFold | לחץ על mFold | בתפריט הנפתח, לחץ על יישומים | צורת קיפול DNA.
   2. הזן את שם הרצף בתיבה והדבק את האמון.
   3. שנה את טמפרטורת הקיפול ל- 60 ° C; בתנאים יוניים, שנה את [Mg⁺⁺] ל- 1.5, ועל יחידות לעבור ל- mM; לחץ על Fold DNA.
   4. בפלט, מתחת למבנה 1, לחץ על pdf כדי לפתוח את חלקות המבנה המעגלי.
2. עבור אל NCBI Blast - Primer Blast לעיצוב פריימר.
3. העתק והדבק את רצף האקסון שנבחר שנקבע על-ידי רצף בשלב 1.1 (הרצף המכיל את המספר הנמוך ביותר של SNPs או ללא SNPs) בתיבה בראש העמוד.
4. השתמש < > הסמלים כדי לסמן ולא לכלול רצפים המכילים SNPs, אתר היעד ואזורים עם היווצרות אפשרית של מבנה משני.
5. בחר את גודל המוצר PCR להיות בין 80 ל 150 bp ובחר את האורגניזם.
   הערה: ניתן להשתמש בהצלחה בגדלי שבר גדולים יותר (~ 300 bp). עם זאת, אמפליקונים ארוכים יותר עשויים להפחית את הרגישות בין רצפים השונים בזוג בסיס אחד או רק בכמה זוגות.
6. לחץ על Get Primers. בחר 2-3 זוגות פריימרים לבדיקה (באופן אידיאלי, אתרי פריימר נמצאים במרחק של ≥20-50 bp מכל אתרי היעד של CRISPR).

3. אימות פריימר

1. בצע PCR הדרגתי באמצעות gDNA מאדם יחיד.
   1. הכן תערובת אב והסר דגימה אחת לפקד שאינו תבנית (NTC) בשפופרת נפרדת. מוסיפים את התבנית לתערובת האב הנותרת ומוסיפים לצלחת בת 96 בארות.
   2. עקוב אחר פרמטרי המחזור: 98 ° C 30 שניות, 34 מחזורים של 98 ° C במשך 10 שניות, 55-65 ° C 30 שניות, 72 ° C 15 שניות; הארכה סופית של 72 ° C למשך 10 דקות.
   3. צור פרופילי התכה תרמית בהתאם לפרמטרים: שלב דנטורציה 95 ° C למשך דקה אחת, חישול 60 ° C למשך דקה אחת, זיהוי עקומת התכה בין 75 ° C ל- 95 ° C במרווחים של 0.2 ° C, עם זמן המתנה של 10 שניות בכל טמפרטורה.
      הערה: יש להשתמש רק בטמפרטורות חישול עם פרופיל התכה תרמי יחיד.

תוצאות

איור 1: זיהוי SNP. ייצוג סכמטי של יישור רצפים מרובים של מקטע AaeZIP11 מטיפוס פראי. באדום הם SNPs, ובירוק הם שברים ללא SNPs; אזור נטול SNP זה מומלץ לתכנון sgRNA ופריימר. קיצורים: SNP = פולימורפיזם נוקלאוטיד יחיד; sgRNA = RNA מדריך יחיד; LVP = זן ליברפול.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
70% אתנול			70% תמיסת אתנול במים
96-well PCR ולוחות PCR בזמן אמת	VWR	82006-636	לקבלת DNA גנומי (מרגל היתוש)
תבניות צלחת 96 בארות			הדפסה ביתית, לרישום גנוטיפ
ביו ראד CFX96	ביו ראד		מכשיר PCR עם יכולות שיפוע ו-HRMA
מאגרי ריאגנטים ביוטכנולוגיים מגוונים	VWR	490006-896
ערכת ניקוי PCR מהירה Exo-CIP	מעבדות ביולוגיות של ניו אינגלנד	E1050S
צלחת פטרי זכוכית	VWR	89001-246	150 מ"מ x 20 מ"מ
Nunc פוליאולפין אקרילט סרט איטום, Thermo Scientific	VWR	37000-548	לשימוש עם לוחות PCR 96 בארות להשגת DNA גנומי
ערכת PCR ישירה לרקמות בעלי חיים (ללא כלי דגימה)	תרמו פישר	F140WH	לקבלת DNA גנומי וביצוע PCR
תוכנת ניתוח Precision Melt	ביו ראד	1845025	משמש לגנוטיפ דגימות הדנ"א של היתושים ולניתוח תכונות הדנטורציה התרמית של DNA דו-גדילי (ראה שלב פרוטוקול 3.3)
פיפטור חד-ערוצי	גילסון
ערכת PCR ישירה לרקמות בעלי חיים (ללא כלי דגימה)	תרמו פישר	F140WH	לקבלת DNA גנומי וביצוע PCR
SeqMan Pro	תוכנת DNAstar Lasergene		ליישור רצפים מרובים
פיפטור חד-ערוצי	גילסון