$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
1. הכנת תערובת Assay
- צור ריכוזי מלאי של 100 μmol/L עבור כל הפריימרים במים ברמה מולקולרית ובדיקות במאגר TE pH 8 [Entero F1A, Entero R1, GPL813TQ; HF183-1, BthetR1, BthetP].
הערה: גשושיות עבור שתי המטרות מסומנות באופן פלואורסצנטי עם פלואורופורים שונים כפי שמצוין ברשימת החומרים/ציוד.
- הכן תערובת מאסטר על ידי ערבוב, לפי תגובה מתוכננת, 12 μl תערובת PCR דיגיטלית (2x מלאי, ראה רשימת חומרים/ציוד), 0.216 μl כל פריימר קדימה ואחורה, 0.06 μl כל בדיקה פלואורסצנטית, ו 5.016 μl מים נטולי nuclease (ריכוז סופי: 900 ננומטר כל פריימר, 250 ננומטר כל בדיקה). פיפטה למעלה ולמטה לפחות 10 פעמים כדי לערבב תוך זהירות לא להכניס בועות אוויר בתמיסה.
- פיפטה 18 μl מאסטר לערבב (משלב 1.2) לתוך צינור PCR רגיל או לוחית, ערבוב בתבנית 6 μl DNA (מופק כפי שתואר קודם לכן) כדי ליצור תערובת בדיקה עבור יצירת טיפות. אם מריצים דגימות כפולות, פיפטה 36 μl של תערובת מאסטר ותבנית DNA 12 μl לתוך כל באר. השאירו את הבארות המשוכפלות המתאימות ריקות על הצלחת. כלול בקרות חיוביות (ראה רשימת חומרים/ציוד) וללא פקדי תבנית (NTC) (כלומר, עם מים ברמה מולקולרית המשמשים כתבנית).
הערה: בקרה חיובית נחוצה כדי להבטיח שהבדיקה פועלת כראוי וה- NTC נחוץ כדי להבטיח שאין זיהום בתוך הצלחת ולהגדיר את הבסיס הפלואורסצנטי מאוחר יותר בניתוח הנתונים. למשתמשים בפעם הראשונה מומלץ להשתמש הן בדגימות DNA לא מדוללות והן בדגימות DNA מדוללות.
2. יצירת טיפות והגדרת צלחת PCR
- מערבבים את תערובות הבדיקה על ידי פיפטציה למעלה ולמטה כ -15 פעמים באמצעות פיפטה רב ערוצית. ודאו שקצה הפיפטה נשאר בתוך הנוזל כדי למנוע יצירת בועות עודפות בתוך התערובת.
- הכנס את מחסנית 1 (המכילה 8 בארות) למחזיק מחסנית לבן ולחץ על מחזיק המחסנית סגור. מחסנית 1 נמצאת כעת במקומה ולא ניתן לעקור אותה מהמחזיק בעת יצירת טיפות. באמצעות צינור רב ערוצי, העבר בעדינות 20 μl של תערובת הבדיקה למצב האמצעי של המחסנית המסומנת 'דגימה' מבלי להכניס בועות אוויר.
- פיפטה ב 70 μl של שמן ייצור טיפות בצד שמאל של המחסנית (מסומן 'שמן').
- כסו את המחסנית באטם וודאו שהאטם שטוח ומוחזק באופן שווה על ידי 4 התקתוקים לכיוון קצה המחסנית. לחץ על לחצן האור הירוק במחולל הטיפות כדי לפתוח ולהניח את המחסנית. לחץ שוב על לחצן אור ירוק כדי לסגור את הגנרטור.
הערה: ברגע שהדלת נסגרת, הכפתור מעומעם, לא ניתן לפתוח מחדש את הדלת וייצור הטיפות מתחיל מיד להימשך כדקה.
- אם אתה מבצע יותר מ-8 תגובות, הנח את מחסנית 2 במחזיק מחסנית לבן שני והתכונן באותו אופן כמו מחסנית 1 בזמן שייצור הטיפות מתבצע כדי לחסוך בזמן ההתקנה הכולל.
- פתח את דלת מחולל הטיפות כאשר הלחצן המואר באור עמום הופך לירוק המציין את השלמת יצירת הטיפות. הסר את מחזיק המחסנית הלבן המכיל את מחסנית 1, הנח אותה בצד והנח את מחסנית 2 על מחולל הטיפות.
- הסר את האטם ממחסנית 1 והשליך. העבר בעדינות את הנפח הכולל (כ- 40 μl) של טיפות שנוצרו מהעמודה השלישית של המחסנית (מסומנת 'טיפות') ללוחית PCR סופית (נשמרת בטמפרטורת החדר) למחזור תרמי.
הערה: אל תבטל את הלחיצה על מחזיק המחסנית הלבן מכיוון שהפעולה עלולה לשבור את הטיפות החדשות שנוצרו; פתח את מחזיק המחסנית רק לאחר העברת הטיפות ללוח הסופי.
- חזור על שלבים 2.1-2.7 לקבלת דוגמאות נוספות.
- כאשר כל הטיפות נמצאות בצלחת ה-PCR הסופית, הניחו כיסוי רדיד אלומיניום הניתן לניקוב על גבי הצלחת והניחו אותו על אטם צלחת. כוונו את חומר האיטום ל-180°C, לחצו על 'הפעל' על חומר האיטום והניחו לאיטום למשך 10 שניות.
3. מחזור תרמי וקריאת טיפות
- הניחו את הצלחת האטומה על המחזור התרמי, כזה התואם ללוחית ה-PCR הסופית המשמשת בשלב 2.7, ומהירות השתוללות טמפרטורה של 2.0°C/sec.
- הפעל תוכנית תרמית באופן הבא: 10 דקות ב- 95 ° C, ואחריו 40 מחזורים של 30 שניות ב- 94 ° C ו- 60 שניות ב- 60 ° C, ולאחר מכן החזקה של 10 דקות ב- 98 ° C (אופציונלי: החזקה סופית ב- 4 או 15 ° C).
- עם סיום המחזור, העבירו את הצלחת לקורא טיפות למדידה אוטומטית של פלואורסצנטיות בכל טיפה בכל באר. לחלופין, אחסנו את הצלחת בטמפרטורה של 4°C למשך עד 3 ימים לפני קריאת הטיפות. ודא שהטיפות נמצאות בטמפרטורת החדר לפני שתמשיך בקריאה.
- פתח את התוכנה הנלווית כדי להגדיר את קריאת הטיפות. בתפריט ברירת המחדל 'Setup' המכיל סכימה של צלחת 96 באר ריקה, לחץ פעמיים על באר A1 כדי לפתוח את התפריט המכיל שלושה חלקים: 'מדגם', 'Assay 1' ו- 'Assay 2'.
- בקטע 'מדגם', הקלד את מזהה הדגימה בתיבה שכותרתה 'שם' ולחץ על Enter או סמן את התיבה משמאל המסומנת 'החל'. לאחר מכן, לחץ על התפריט הנפתח שכותרתו 'ניסוי' ובחר 'אדום' (זיהוי אירועים נדירים) ולחץ על Enter.
- עבור לקטע המסומן 'Assay 1'. בקטע 'שם' מלא את הבדיקה (לדוגמה, Enterococcus) ולחץ על Enter. בתיבה שמתחת לכותרת 'סוג', לחץ על התפריט הנפתח ובחר 'ערוץ 1 לא ידוע' ולחץ על Enter.
- עבור למקטע המסומן 'Assay 2'. בקטע 'שם', מלא את הבדיקה (לדוגמה, HF183) ולחץ על Enter. בתיבה שמתחת לכותרת 'סוג', לחץ על התפריט הנפתח ובחר 'ערוץ 2 לא ידוע' ולחץ על Enter. כל המידע משלבים 3.3.2 עד 3.3.4 נמצא כעת בבאר A1.
- תן שם לכל הבארות הבאות המכילות טיפות. כדי לחסוך זמן התקנה כולל, לחץ על 'Shift' או 'Ctrl', כדי לבחור מספר בארות בו זמנית.
- כאשר התיאור הדיגיטלי של הצלחת משקף את הצלחת הפיזית, לחץ על 'אישור' בפינה השמאלית התחתונה של התפריט. בתפריט החדש שמופיע בראש סכמת הצלחת, תחת הקטע 'תבנית' בחר 'שמירה בשם' ותן שם ושמור את הצלחת.
- משמאל למסך, לחץ על 'הפעלה' ובחר ערכת צבע מתאימה בחלון הקופץ "אפשרויות הפעלה". איסוף הנתונים יוזם ומוצג בזמן אמת בתוכנה.