PCR כמותי בזמן אמת לאבחון זיהומים ויראליים

תקציר

מקור: Marston, D. A. et al. Pan-lyssavirus Real Time RT-PCR for Rabies Diagnosis. J. Vis. Exp. (2019).

סרטון זה מדגים שיטה כמותית לזיהוי זיהום ויראלי באמצעות PCR שעתוק לאחור בזמן אמת. שלב השעתוק ההפוך ממיר את הרנ"א ל-cDNA, אשר לאחר מכן מוגבר באמצעות מחזורי PCR. נוכחותו של RNA ויראלי במדגם מאושרת על ידי ניתוח עקומות ההגברה והדיסוציאציה של ה- DNA המתקבל מה- PCR.

פרוטוקול

1. כימות RNA באמצעות ספקטרופוטומטר מיקרו-נפחי

1. ודא שהגדרות הספקטרופוטומטר מוגדרות ל- RNA.
2. השתמש ב- 1-2 μL של מים ברמה מולקולרית כדי לאתחל את המכונה ולהגדיר קו בסיס.
3. השתמש 1-2 μL של כל דגימת RNA הבדיקה כדי להעריך את כמות RNA.
4. שמור את הקריאות והמסמך.
5. התאם את הרנ"א ל-1 מיקרוגרם/μL, במידת הצורך.
   הערה: RNA חייב להישמר על קרח (או בגוש קריר) בכל עת. אם RNA מתקבל באמצעות עמודה, או שיטה מבוססת חרוזים, RNA הוא בדרך כלל פחות מ 1 מיקרוגרם / μL. במצב זה להשתמש RNA מסודר.

2. הכנת סדרת דילול RNA לקביעת רגישות נקודת הקצה

1. בצע דילול סדרתי פי 10 של הרנ"א.
   1. מסמנים צינורות עם סדרת הדילול (למשל, ^10-1, ^10-2 וכו') ופרטי הרנ"א.
   2. הוסף 45 μL של מים ברמה מולקולרית לכל צינור.
   3. מוסיפים 5 μL של RNA (בעבר מדולל ל 1 מיקרוגרם / μL) ומערבבים היטב.
   4. יש להשליך את קצה הפיפטה מחומר החיטוי המתאים ולהחליף אותו בקצה טרי.
   5. קח 5 μL מ ^10-1 ולהוסיף ^10-2 צינור ומערבבים היטב.
   6. חזור על 2.1.3-2.1.5 עם שאר הדילולים.
      הערה: RNA חייב להישמר על קרח (או בגוש קריר) בכל עת.

3. הכנת תגובות RT-PCR בזמן אמת

1. באמצעות גיליון אלקטרוני, תכנן את פריסת הלוחות בהתאם למספר דגימות הבדיקה ודגימות הבקרה, הן עבור מבחני lyssavirus והן עבור מבחני ß-actin.
   הערה: אם יש לבדוק 4 דגימות כפולות עם בקרה חיובית ושלילית, זה שווה ל -10 תגובות עבור שתי הבדיקות.
2. ב'חדר נקי' או באזור נפרד מתבנית ה-RNA, נגבו את המשטחים בחומר חיטוי מתאים לפני השימוש או הכינו עמדת עבודה PCR (אם משתמשים). להכנת עמדת העבודה, נגבו את משטח הארון בחומר חיטוי מתאים, הכניסו את הפריטים הדרושים לעמדת העבודה וסגרו את הדלתות. הפעל את אור ה- UV למשך 10 דקות.
3. מוציאים ריג'נטים ופריימרים מהמקפיא ומפשירים (ריאגנטים המפורטים בטבלה 1 ופריימרים בטבלה 2).
   הערה: תערובת האנזימים מאוחסנת בגליצרול ולכן אינה דורשת הפשרה ויש לשמור אותה על קרח (או בגוש קריר) בכל עת. כל שאר הריאגנטים ניתנים להפשרה בטמפרטורת החדר.
4. לאחר ההפשרה, מערבבים את הריאגנטים והצנטריפוגה לזמן קצר כדי לאסוף את הנוזל.
   הערה: אין לערבל את תערובת האנזימים, אלא רק צנטריפוגה לזמן קצר.
5. הכינו תערובות מאסטר נפרדות עבור lyssavirus ו-ß-actin. עבור כל תגובה, הוסף 7.55 μL של מים ברמה מולקולרית, 10 μL של 2x תערובת תגובה ירוקה אוניברסלית SYBR, 0.6 μL של פריימר קדמי, 0.6 μL של פריימר הפוך, 0.25 μL של תערובת אנזימים iTaq RT.
   1. השתמש בגיליון אלקטרוני כדי לחשב אמצעי אחסון נכונים כדי למנוע שגיאות בחישוב ידני. ודא מספיק מאסטר-מיקס מוכן כדי לפצות על טעויות pipetting. לכן, אם נדרשות 10 תגובות (ראה הערה ב-3.1), הכינו 12 תגובות
   2. הכינו את תערובת המאסטר על קרח (או בגוש קריר) והישארו על קרח עד להכנסתו למכונה בזמן אמת.
6. ערבבו את תערובות המאסטר המוכנות, צנטריפוגות לזמן קצר, ושחררו 19 μL לבארות הרלוונטיות של צינורות רצועה או צלחת 96 בארות התואמת למכונה בזמן אמת בשימוש.
   הערה: צמצם את ייצור הבועות בבארות בזמן הפיפט.
7. בחדר נפרד, או בארון UV שהוכן כמתואר ב-3.2, יש להוסיף בזהירות 1 μL של ה-RNA שהותאם קודם לכן ל-1 מיקרוגרם/μL (ראה שלב 1.5) מתחת לפני השטח של המאסטר המתאים לערבב היטב ולערבב בעדינות. יש להשליך את קצה הפיפטה לחומר חיטוי מיד לאחר השימוש (מתחת לפני השטח).
   1. הוסף את הפקדים לאחר דגימות הבדיקה, כאשר הבקרה החיובית נוספה הבאה ובקרת ללא תבנית (NTC - מים ברמה מולקולרית) נוספה אחרונה. כמות הרנ"א המשמשת יכולה להשתנות בהתאם לסוג הדגימה, ומיצוי RNA בשימוש. יש לאמת את הכמות המשמשת כדי להבטיח שהתגובה ממוטבת.
8. יש לאטום את הפלטה באמצעות מכסי רצועות או חומר איטום תוך הקפדה על כך שכל המכסים סגורים היטב ומסומנים מספיק כדי לכוון את הדגימות. תייגו את קצה צינורות הצלחת/הרצועה.
9. סובבו את הדגימות באמצעות צנטריפוגה כדי לאסוף את כל הנוזלים בתחתית הבארות.
10. העבירו את הצלחת למכונת PCR בזמן אמת, פתחו את הדלת והניחו אותה במחזיק תוך הבטחת המיקום/כיוון הנכון של הדגימות בהתאם לפריסת הצלחת.
    הערה: אם נעשה שימוש ברצועות צינור, ודא שהמחזיק נמצא במקומו.
11. פתח את תוכנית מכונת ה- PCR בזמן אמת ובחר באפשרות לניסוי בזמן אמת של SYBR עם עקומת דיסוציאציה. תכנת את מכונת ה-PCR בזמן אמת באמצעות תנאי המחזור התרמי המפורטים בטבלה 3, כולל נקודות איסוף הנתונים.
12. בחר SYBR כצבע הפלואורסצנטי ובחר לא ידוע כסוג הדגימה והוסף שם לתיבת שם הדגימה הנכונה.
    הערה: להבדיל בין replicates וגם בין lyssavirus ו ß-actin בארות.
13. בחר מיקום קובץ כדי לשמור את נתוני הניסוי, ודא שהמנורה תכבה בסוף ההפעלה ולאחר מכן התחל את run.
    הערה: מכיוון שהצעד הראשון הוא שלב RT, לא נאספים נתונים במהלך תקופה זו, לכן, אם המנורה דורשת תקופת התחממות הדבר עשוי להתרחש במהלך שלב RT. המכונה והתוכנה בזמן אמת יציגו את עקומות ההגברה בזמן אמת, בעוד שעקומת ההיתוך תיווצר בסוף המחזור.

תוצאות

טבלה 1: ריאגנטים של תערובת מאסטר RT-PCR בזמן אמת של Pan-lyssavirus.

...

מגיב	μL/תגובה
מים ברמה מולקולרית	7.55
2x תערובת תגובת PCR אוניברסלית RT	10
פריימר קדימה [20 מיקרומטר]	0.6
פריימר הפוך [20 מיקרומטר]	0.6

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
קצוות פיפטה Art Barrier (בגדלים שונים)	תרמופישר	מגוון
צנטריפוגה	בקמן	אלגרה 21R	רוטור המסוגל להכיל 96 לוחות באר נדרשים. שלב 3.8.
צנטריפוגה (מיקרו)	סיגמא
Finnpipettes (כדי לחלק 0.5-1000 μL)	תרמופישר	מגוון
ערכת iTaq Universal SYBR Green One-Step RT-PCR	ביו-ראד	172-5150	ניתן להשתמש בערכות שוות ערך אם הן מאומתות
MX3000P או MX3005P מערכת PCR בזמן אמת	סטרטג'ן	לא ישים	ניתן להשתמש במכונות שוות ערך אם הן מאומתות
בסיס לוחית תגובה MicroAmp	כל מתאים		משמש להחזקת רצועת צינור וצלחות בצורה מאובטחת.
רצועות שקופות שטוחות שקופות אופטית (8)	אבגן	AB-0866
מסגרת התאמה מושלמת (אם משתמשים ברצועות צינור)	סטרטג'ן	לא ישים	ספציפי למכונה
פריימרים: לפרטים על פריימר ראו טבלה 2.			הוזמן בקנה מידה 0.05 μmole HPLC מטוהר.
צלחות תרמו-מהירות 96 בארות, ללא חצאיות	אבגן	AB-600
רצועות תרמו-מהירות (8) צינורות תרמיים	אבגן	AB-0452
מכונת וורטקס / Whirlimixer	פיסונס ציוד מדעי	SGP-202-010J
אלא אם צוין אחרת, ניתן להשתמש בציוד חלופי