חסימת PCR מסוג Wild לאיתור מוטציות סומטיות בתדר נמוך

תקציר

מקור: Albitar, A. Z. et al., Wild-type Block PCR בשילוב עם ריצוף ישיר כשיטה רגישה ביותר לאיתור מוטציות סומטיות בתדירות נמוכה. J. Vis. Exp. (2017).

סרטון זה מתאר תגובת שרשרת פולימראז חוסמת מסוג פראי, או WTB-PCR, המזהה מוטציות סומטיות. הטכניקה מבוססת PCR משתמשת בחומצת גרעין נעולה, או LNA, אוליגונוקלאוטיד שנקשר לאלל הבר המשלים שלו וחוסם את התארכותו. החסימה מאפשרת באופן סלקטיבי הגברה של אללים מוטנטיים ברמה נמוכה על פני הגרסאות הפראיות שלהם בדגימה.

פרוטוקול

1. מיצוי DNA מרקמת FFPE, דם היקפי ומח עצם שואפים

1. עבור רקמת מח עצם FFPE עם ערכת מיצוי DNA FFPE
   1. התחל עם רקמת FFPE משקופיות לא מוכתמות (5 - 10 חלקים בעובי 5 - 10 מיקרומטר).
      הערה: אם מתחילים בשבבי רקמות, יש להשתמש ב-3-6 מקטעים בעובי 5-10 מיקרומטר ולדלג לשלב 1.1.6.
   2. הניחו את המגלשות בסלסלת שקופיות והכינו ארבעה מאגרי שטיפה (שניים לקסילן ושניים ל-100% אלכוהול). הוסף נפח מינימלי של 600 מ"ל של הפתרון לכל סל.
   3. נטרלו את המגלשות על ידי שטיפת קסילן של 5 דקות במגש הראשון. מעבירים את המגלשות למיכל שטיפת הקסילן השני למשך 5 דקות נוספות.
   4. לאחר הסרת הפרפריפיניזציה, שטפו את המגלשות ב-100% אלכוהול למשך 5 דקות. העבירו את המגלשות למאגר שטיפת האלכוהול השני למשך 5 דקות נוספות.
   5. הניחו למגלשות להתייבש לחלוטין מתחת למכסה המנוע לפני שתגרדו אותן עם סכין גילוח לתוך צינור מיקרוצנטריפוגה.
      הערה: אם קיימת שקופית H&E עם אזור הגידול שצוין, יש ליישר את המגלשות ולגרד רק את אזור הגידול.
   6. המשך עם ההוראות מדף המידע של היצרן הכלול בערכה.
2. עבור BM לשאוף דם היקפי
   1. חלץ בהתאם להוראות היצרן עם מפרטים אלה.
      הערה: ישנן ערכות ושיטות רבות הזמינות מסחרית למיצוי DNA מרקמות ותאי FFPE. מעשית, ניתן להשתמש בכולם. השתמש בשיטה שנקבעה במעבדה.
      1. השתמש 200 μL דם היקפי (PB) או 100 μL BM + 100 μL PBS.
      2. השתמש 4 μL RNase פתרון מניות.
      3. Elute עם 100 μL elution buffer.
3. כימות DNA
   1. מדידת ריכוזי DNA באמצעות ספקטרופוטומטר המבטיח יחס של 260 ננומטר/280 ננומטר של כ-1.8 (עבור DNA טהור). אם היחס נמוך במידה ניכרת, הדבר עשוי להצביע על נוכחות של חלבון, פנול או מזהמים אחרים שעלולים להפריע ליישומים במורד הזרם.
   2. התאם את ריכוזי הדנ"א לכ- 50 - 100 ננוגרם/מיקרוליטר עם חיץ אלוציה מתאים.

2. חסימת PCR מסוג פראי

1. עיצוב פריימר
   1. תכננו והשיגו פריימרים לגנים בעלי עניין בהתאם להנחיות הכלליות שתוארו קודם לכן של תכנון פריימר PCR. כלול פריימרים לריצוף אוניברסלי M13-forward ו-reverse בפריימרים PCR.
      הערה: בדיקת MYD88 פותחה כדי להגביר את אקסון 5 של MYD88 (G259 - N291) ו-110 נוקלאוטידים הממוקמים באזור האינטרוני 5' כדי לכסות את אתר החיתוך וחלק מאינטרון 4. הפריימרים קדימה ואחורה תוכננו ברצף 5'-M13 (M13- קדימה: tgt aaa acg acg gcc agt; M13-הפוך: cag gaa aca gct atg acc) כדי לאפשר חישול של פריימרים משלימים לריצוף (ראה טבלת חומרים).
2. עיצוב אוליגונוקלאוטיד של חומצת גרעין נעולה
   1. תכנן את האוליגונוקלאוטיד החוסם כך שיהיה באורך של כ-10 - 15 בסיסים וישלים את תבנית WT שבה רוצים העשרה מוטנטית.
      הערה: אוליגו קצר יותר ישפר את אפליית חוסר ההתאמה. כדי להשיג ספציפיות מטרה גבוהה, חשוב לא להשתמש ביותר מדי נוקלאוטידים חוסמים מכיוון שזה יכול לגרום לאוליגונוקלאוטיד "דביק" מאוד. התוכן והאורך והנוקלאוטיד החוסם צריכים להיות אופטימליים בהתאם לנוקלאוטיד הספציפי שצריך לחסום. חשוב להשיג ספציפיות מחייבת גבוהה מבלי לפגוע במבנה המשני ולהסתכן בהשלמה עצמית.
   2. תכנן את אוליגו החסימה כך שיהיה T_m 10 - 15 ° C מעל טמפרטורת ההרחבה במהלך thermocycling. התאימו את ה-T_m על ידי הוספה או הסרה של בסיסים חוסמים או על ידי החלפת בסיסים חוסמים ב-DNA תוך הימנעות ממתיחות ארוכות (3-4 בסיסים) של בסיסי G או C חוסמים.
      1. נווט אל אתר הכלים של אוליגו (ראה טבלת חומרים) ובחר בכלי "חסימת חיזוי אוליגו T_m".
      2. הדבק את הרצף של תבנית WT הרצויה להיחסם בתיבה "רצף אוליגו". הוסף "+" לפני בסיסים כדי לציין בסיסי חוסם.
      3. בחר בלחצן "חשב" כדי לקבוע את T_m המשוער של הכלאיים חוסם DNA.
   3. תכננו את האוליגו החוסם כך שימנע היווצרות מבנה משני או דימרים עצמיים.
      1. נווט אל אתר הכלים של אוליגו (ראה טבלת חומרים) ובחר בכלי "חסימת Oligo Optimizer".
      2. הדבק את הרצף של תבנית WT הרצויה להיחסם בתיבה. הוסף "+" לפני בסיסים כדי לציין בסיסים חוסמים.
      3. בחר את שתי התיבות עבור "מבנה משני" ו"עצמי בלבד". לחץ על הלחצן נתח כדי לסקור את האוליגו עבור מבנים משניים או דימרים עצמיים שעלולים להיות בעייתיים.
         הערה: הציונים מייצגים הערכות גסות מאוד של ה-T_m של המבנים המשניים והעמומים העצמיים. לכן ציונים נמוכים יותר הם אופטימליים וניתן להשיג אותם על ידי הגבלת צימוד חוסם-חוסם. האוליגונוקלאוטיד החוסם עבור MYD88 [חוסם MYD88 (TCAGA+AG+C+G+A+C+T+G+A+T+CC/invdT/)] תוכנן לכסות חומצות אמינו Q262-I266 וכולל dT הפוך בגודל 3 אינץ' כדי לעכב את שתי ההרחבות על ידי DNA פולימראז ואת הפירוק על ידי 3'-exonuclease. אוליגו חסימה ספציפי זה הוא 17 mer עם 10 בסיסי חסימה המסומנים כ- "+N". 7 הבסיסים הנותרים הם נוקלאוטידים רגילים של DNA.
3. הגדרת WTB-PCR ורכיבה על אופניים תרמיים
   1. הכן תערובת מאסטר WTB-PCR (MMX) באמצעות מאגר תגובת PCR של 2.5 μL 10x עם 20 mM MgCl₂, 250 μM dNTPs, פריימר 0.2 מיקרומטר קדימה ואחורה, חוסם MYD88 של 1.2 מיקרומטר ו- DNAse, נטול RNAse, טהור במיוחד H₂O כדי ליצור נפח תמיסה סופי של 21.75 μL לכל תגובה.
      הערה: ריכוזי העבודה הם עבור נפח התגובה הסופי של 25 μL (לאחר הוספת תבנית DNA ופולימראז). PCR MMX קונבנציונאלי מוכן פשוט על ידי השמטת תוספת של חוסם. כל שלבי הפרוטוקול נשארים זהים הן עבור WTB והן עבור PCR רגיל. זה יכול לשמש באימות וקביעת העשרה המושגת על ידי תוספת של חוסם.
      1. בעת חישוב כמות MMX להכנה, הקפד לקחת בחשבון 3 תגובות נוספות (בקרות חיוביות ושליליות ובקרה שאינה תבנית לבדיקת זיהום) ולפחות תגובה אחת נוספת לשגיאת צנרת.
   2. מערבולת MMX ביסודיות. MMX ניתן לאחסן ב -80 ° C עד שנה.
   3. הוסף 0.25 μL Taq DNA פולימראז לכל תגובה ל-MMX והפוך כדי לערבב. לאחר הוספת הפולימראז ל-MMX, יש לשמור אותו על קרח.
   4. שים צלחת PCR חדשה 96 באר על צלחת קרה פיפטה 22 μL של MMX עם פולימראז לכל תגובה היטב.
   5. הוסף 3 μL DNA גנומי (50 - 100 ng / μL לכל אחת הבארות המכילות MMX עם פולימראז.
   6. אטמו את הצלחת והצנטריפוגה לזמן קצר כדי להבטיח שהתמיסה תגיע לתחתית כל באר.
   7. טען את צלחת ה- PCR על thermocycler.
      1. הגדר את התנאים התרמו-מחזוריים עבור תגובת WTB-PCR כדלקמן: דנטורציה ראשונית ב- 95 ° C למשך 6 דקות; 40 מחזורים של דנטורציה ב- 95 ° C למשך 30 שניות, חישול פריימר ב- 56 ° C למשך 30 שניות, והארכה ב- 72 ° C למשך דקה 20 שניות; הארכה סופית ב- 72 ° C למשך 10 דקות.
         הערה: שיטות עבודה מומלצות כוללות השלמת שאר הפרוטוקול באזור נפרד פיזית כדי למנוע זיהום אמפליקון בהגדרות עתידיות.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
1.5 או 2 מ"ל צינורות מיקרוצנטריפוגות Safe-Lock	אפנדורף	05-402-25
100% אלכוהול	VWR	89370-084	כיתה היסטולוגיה; 91.5% אתנול, 5% אלכוהול איזופרופיל, 4.5% מתיל אלכוהול
רדידי איטום אלומיניום	GeneMate	T-2451-1	עבור PCR ואחסון קר
סדרת צנטריפוגות 5804	אפנדורף		רוטור A-2-DWP (עבור צלחת PCR)
צלחת קרה לצלחות 96 בארות	אפנדורף	Z606634
DNAse, ללא RNAse, מים טהורים במיוחד
dNTPs (100 mM)	Invitrogen	10297-117
אתנול אבסולוט	סיגמא	E7023	200 הוכחות, לביולוגיה מולקולרית
אתר האינטרנט של Exiqon Oligo Tools			http://www.exiqon.com/oligo-tools
FastStart Taq DNA פולימראז (5 U/μL)	רוש	12032937001	עם מאגר תגובת PCR מרוכז פי 10, עם 20 mM MgCl2
מכשיר אלקטרופורזה ג'ל			2% ג'ל אגרוז
אוליגונוקלאוטיד LNA	אקסיקון	500100	5'-TCAGA+AG+C+G+A+C+T+G+A +T+CC/invdT/ (+N = בסיסי LNA)
Mastercycler Pro S Thermocycler	אפנדורף	E950030020
מיקרוצנטריפוגה דגם 5430	אפנדורף		רוטור FA-45-30-11 (עבור צינורות מיקרוצנטריפוגות 1.5/2 מ"ל)
ספקטרופוטומטר NanoDrop 2000	תרמו פישר סיינטיפיק
פריימר PCR קדימה	IDT		5'-tgt aaa acg acg gcc agt TGC CAG GGG TAC TTA GAT GG
פריימר הפוך PCR	IDT		5'-CAG GAA ACA GCT ATG ACC GGT TGG TGT AGT CGC AGA CA
צלחות PCR	GeneMate	T-3107-1
פיפטורים			20, 200, 1,000 מיקרוליטר
ערכת מיני QIAamp DNA	קיאגן	51304	עבור BM לשאוף דם היקפי
מערבולת ג'יני	תעשיות מדעיות	ת"י 0236
סל שקופיות