תגובת שרשרת כמותית של פולימראז לספירת בקטריופאג'ים

תקציר

מקור: Peng, X., et al., PCR כמותי של T7 Bacteriophage מ Biopanning. J. Vis. Exp. (2018)

בסרטון זה אנו דנים בתגובת השרשרת הכמותית של פולימראז, qPCR, כדי למנות בקטריופאג'ים מסוג T7 באמצעות כימות DNA. הצבע הפלואורסצנטי בתערובת ה-PCR נקשר לגדילים החדשים של הדנ"א המסונתז ופולט פלואורסצנטיות, הנמדדת.

פרוטוקול

1. הכנת תגובות qPCR

הערה: תגובת PCR אחת היא עבור דגימה אחת. כל תגובת PCR מכילה 5 μL של תערובת מאסטר qPCR (ראו חומרים), 1 μL של תערובת זוגות פריימר 5 μM, 2 μL של H₂O ו-2 μL של דגימת פאגים T7 שטופלה בחום. עבור תגובות PCR מרובות, כל הריאגנטים למעט דגימת הפאגים מעורבבים מראש בצינור אחד של 1.5 מ"ל. הנפח של כל מגיב בפרמיקס תלוי במספר דגימות הפאגים עבור qPCR.

1. הכינו את ה-qPCR premix עבור 10 דגימות פאגים ביו-פאנלים בריכוז לא ידוע ו-7 דגימות של ריכוזים סטנדרטיים בטריפליקט. כתוצאה מכך, יש 51 דגימות בסך הכל ולכן 51 תגובות qPCR (כלומר, תגובה אחת לכל דגימה). עבור 51 תגובות, להכין premix של 255 μL של תערובת מאסטר qPCR (51x 5 μL), 51 μL של פריימרים (51x 1 μL), ו 102 μL של H₂O (51x 2 μL).
   הערה: מומלץ להכין כמה תגובות PCR נוספות כדי לפצות על אובדן נפח במהלך aliquoting תערובת PCR לתוך כל באר של צלחת qPCR 96-well.
2. Aliquot 8 μL של premix PCR לתוך כל באר של צלחת qPCR 96-well עבור סך של 51 בארות (כלומר, 51 תגובות qPCR). אין צורך לשנות טיפים במהלך aliquoting.
3. הוסיפו 2 μL של דגימות פאגים T7 שטופלו בחום או דנ"א ייחוס של פאגים T7 לכל באר (איור 1B); שנו טיפים בעת הוספת דגימות דנ"א שונות לבאר כדי למנוע זיהום צולב. כמו כן, יש להוציא את דגימות ה-DNA של 2 μL מתחת לפני השטח של ה-qPCR premix (כלומר, לתוך premix 8 μL PCR).
4. אטום את צלחת qPCR עם סרט דבק.
   הערה: שלב זה הוא קריטי, ללא קשר לסוג צלחת qPCR. השתמש בערכה המומלצת כדי לאטום את הצלחת לחלוטין; אחרת, כל אזור שאינו אטום בצלחת יגרום לאובדן נפח במהלך מחזור PCR.
5. עטפו את צלחת ה-qPCR ברדיד אלומיניום כדי למזער הלבנה פלואורסצנטית והמשיכו להפעיל אותה על ציוד ה-qPCR.

2. תנאי רכיבה על אופניים qPCR

הערה: תנאי מחזור qPCR הוגדרו על ציוד qPCR ספציפי.

1. הפעל את צלחת qPCR 96-well על ציוד qPCR. בציוד, בחר הגדרות מהתפריט כדי להגדיר את תנאי הניסוי הבאים (איור 1C).
2. הגדר את תנאי המחזור באופן הבא עבור נפח דגימה של 10 μL: מחזור אחד ב- 50°C למשך 2 דקות, מחזור אחד ב- 95°C למשך 2 דקות, ולאחר מכן 40 מחזורים של (95°C למשך 15 שניות, 60°C למשך דקה אחת). לאחר מכן, הפעל את הגדרות עקומת ההמסה: מחזור אחד של 95°C למשך 15 שניות, 60°C למשך דקה אחת ו- 95°C למשך 15 שניות.
3. המשך לנתח את הנתונים.

תוצאות

איור 1: טיפול בדגימות פאג'ים, הכנת תגובת qPCR וריצת qPCR. DNase I טיפל מראש בדגימות פאגים מסוג T7 שחוממו בטמפרטורה של 100 מעלות צלזיוס במשך 15 דקות כדי לשחרר את הדנ"א T7 מחלקיקי פאגים שלמים (A); תערובת qPCR הוכנה כמתואר בפרוטוקול. כל ההכנות נעשו על קרח (A); ציוד qPCR ותוכנה תואמת (B) שימשו להגדרת תנאי המחזור, הפעלת מחזורי PCR, רכישה וניתוח הנתונים הג...

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
פריימרים לדנ"א גנומי T7	IDT		F: CCTCTTGGGAGAGAGATTTTTG R: TACGGGTCTCGTAGGACTTAAT
T7 בחר DNA של בקרת אריזה	EMD Millipore	69679-1UG
צלחת תגובה אופטית MicroAmp 96 באר	תרמופישר סיינטיפיק	N8010560
תערובת מאסטר qPCR-הספק תערובת מאסטר ירוקה של SYBR	מערכות ביולוגיות יישומיות	מערכות ביולוגיות יישומיות
ערכת סרט הדבקה אופטית MicroAmp	תרמופישר סיינטיפיק	תרמופישר סיינטיפיק
UltraPure DNase/RNase ללא מזוקק H2O	Invitrogen	10977015
מערכת PCR בזמן אמת ViiA7 עם בלוק מהיר של 96 בארות	תרמופישר סיינטיפיק	4453535
תוכנת PCR בזמן אמת QuantStudio	תרמופישר סיינטיפיק		v1.2