$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
1. PCR אסימטרי להגברת ssDNA
- הכינו תערובת מגיב PCR אסימטרית להגברת ssDNA לניתוח. הפשירו את הריאגנטים בטבלה 1 על קרח. אין לשמור את האנזים Taq פולימראז (50 U/μL) על קרח, אלא לאחסן אותו בטמפרטורה של 20°C עד לצורך.
- מערבלים בעדינות את כל הריאגנטים ולאחר מכן לזמן קצר צינורות צנטריפוגות ב 10,000 x גרם במשך 10 שניות.
- שלב את כל הריאגנטים כמתואר בטבלה 1.
- הכניסו את הדגימות לתרמוסייקלר והתחילו את ה-PCR הא-סימטרי בתנאים הבאים: 25 מחזורים (95°C למשך 30 שניות, 52°C למשך 30 שניות ו-72°C למשך 30 שניות), 85°C למשך 5 דקות, החזיקו ב-4°C.
2. מיקרוספירה-PCR להגברת ssDNA
הערה: סעיף זה מתאר את הפרוטוקול להגברת ssDNA בצינור תגובת PCR. תגובות מיקרוספירה-PCR בוצעו בנפח תגובה של 50 מיקרוליטר. הרצפים המפורטים המשמשים להגברת ssDNA מפורטים בטבלה 2. במקרה זה, Ap על פני השטח של מיקרוספרות יכול להתחנף לתבניות DNA אקראיות באופן משלים. זהו שלב חשוב מאוד לייצור גדילי דנ"א משלימים (גדיל דנ"א אנטיסנס, איור 1). הדנ"א המורחב משמש כתבנית להגברה מיקרוספרית-PCR.
- הכן תערובת מגיב microsphere-PCR. הפשירו את הריאגנטים בטבלה 3 על קרח; עם זאת, אין לשמור את האנזים Taq פולימראז על קרח. יש לאחסן בטמפרטורה של -20°C עד לצורך.
- מערבלים בעדינות את כל הריאגנטים ולאחר מכן לזמן קצר צינורות צנטריפוגות ב 10,000 x גרם במשך 10 שניות.
- השג כ~ 25 מיקרוספרות באמצעות ספירה מיקרוסקופית.
הערה: מספר המיקרוספרות בצינור תגובה אחד מחושב באמצעות מיקרוסקופ אור עם הגדלה של פי 40. כ~25 מיקרוספרות משמשות להגברת מיקרוספירה-PCR. מידע מפורט יותר נמצא בשלב 3.
- שלב את כל הריאגנטים כמתואר בטבלה 3.
- הכניסו את הדגימות לתרמוסייקלר והתחילו את ה-PCR הא-סימטרי בתנאים הבאים: 25 מחזורים (95°C למשך 30 שניות, 52°C למשך 30 שניות ו-72°C למשך 30 שניות), 85°C למשך 5 דקות, החזיקו ב-4°C.
- לאחר ההגברה, יש להוסיף 8 μL של חיץ העמסה פי 6 ולהעמיס 15 μL מכל דגימה לג'ל אגרוז 2%. לאחר מכן, בצע אלקטרופורזה ב 100 V במשך 35 דקות ב 1x TAE (Tris-אצטט-EDTA, 40 mM Tris-אצטט, 1 mM EDTA, pH 8.2) חיץ.
טבלה 1. מגיב PCR אסימטרי מערבב רכיבים בתגובה של 20 μL.
| מגיב | נפח עבור תגובה אחת (μL) | ריכוז סופי |
| תבנית DNA אקראית | 1 | 1 נ"ג/μL |
| פריימר תג-קדימה | 1 | 0.4 מיקרומטר |
| פריימר הפוך | 1 | 0.02 מיקרומטר |
| מאגר Taq פי 10 | 5 | פי 1 |
| 10 מ"מ של dNTP | 4 | 2.5 מ"מ |
| אקס טאק (1000U) | 0.2 | 1 U |
| מים | 37.8 | - |
| סך | 50 | - |
טבלה 2. מידע רצף עבור Microsphere-PCR.
| תבנית | רצף | אורך (nt) |
| תבנית DNA אקראית | 5'- ATA CCA GCT TAT TCA ATT (רצף אקראי, 40 MER) AGA TAG TAA GTG CAA TCT-3' | 76 |
| פריימר Tag-Forward (Tag-F) | 5'- GGT AAT ACG ACT CAC TAT AGG GAG ATA CCA GCT TAT TCA ATT-3' | 42 |
| פריימר הפוך | 5'- AGA TTG CAC TTA CTA TCT-3' | 18 |
טבלה 3. רכיבי תערובת מגיב מיקרוספירה-PCR בתגובה של 50 μL
| מגיב | נפח עבור תגובה אחת (μL) | ריכוז סופי |
| אפ-מיקרוספרות | ~25 מיקרוספרות | - |
| תבנית DNA אקראית | 1 | 1 נ"ג/μL |
| פריימר Tag-Forward | 1 | 0.4 מיקרומטר |
| מאגר Taq פי 10 | 5 | פי 1 |
| 10 mM dNTP | 4 | 2.5 מ"מ |
| אקס טאק (1000U) | 0.2 | 1 U |
| מים | 37.8 | - |
| סך | 50 | - |
