PCR מקונן כדי לזהות רצף גנומי ויראלי ספציפי

תקציר

מקור: Feng, Y., et al. הערכה של תגובת שרשרת פולימראז אוניברסלית מקוננת בשעתוק לאחור לזיהוי ליזה-וירוסים. J. Vis. Exp. (2019).

סרטון זה מתאר תגובת שרשרת פולימראז מקוננת, טכניקה המורכבת משני תהליכי הגברה רציפים של PCR באמצעות שתי ערכות פריימר. קבוצת הפריימרים הראשונה מיועדת לרצף במעלה הזרם של הקבוצה השנייה, וכתוצאה מכך הגברה סלקטיבית של רצפי גנים ספציפיים. PCR זה רגיש וספציפי יותר מאשר PCR רגיל והוא נמצא בשימוש נרחב כטכניקת זיהוי עבור מחלות שונות.

פרוטוקול

1. שעתוק לאחור של הרנ"א הנגיפי

1. הוציאו מהמקפיא את ריאגנטי RT המפורטים בטבלה 1, שמרו אותם על קרח והפשירו וערברו אותם לפני השימוש.
2. הכן 12 μL של תערובת תגובת RT בצינור PCR של 0.2 מ"ל עם הריאגנטים המפורטים בטבלה 1. אפשר וריאציות צנרת על ידי הכנת נפח של תערובת האב לפחות גודל תגובה אחד גדול מהנדרש.
3. הוסף דגימה של 8 μL, RNA בקרה חיובית או בקרה שלילית לתמהיל תגובות RT בתוך תחנת עבודה PCR בחדר תבניות. הבקרה החיובית RT היא RNA המופק מתרבית התאים הנגועה בזן RABV קבוע CVS-11 (תקן וירוס אתגר -11) ומאוחסן בטמפרטורה של -80 מעלות צלזיוס. הבקרה השלילית מכילה ddH₂O ללא RNase.
4. מערבבים את התוכן של צינורות RT על ידי vertexing; לאחר מכן, צנטריפוגה לזמן קצר.
5. טען את צינורות התגובה לתוך מחזור תרמי. הגדר את תוכנית סינתזת cDNA בתנאים הבאים: 42°C למשך 90 דקות, 95°C למשך 5 דקות ו- 4°C בהמתנה. הגדר את עוצמת הקול של התגובה ל- 20 μL. התחל את ריצת RT.

2. PCR סיבוב ראשון

1. שמרו את ריאגנטי ה-PCR רשומים בטבלה 2 על קרח בחדר נקי עד לשימוש; לאחר מכן, הפשירו וערברו אותם.
2. הכן את תערובת ה- PCR של הסיבוב הראשון בצינור PCR של 0.2 מ"ל עם הריאגנטים המפורטים בטבלה 2.
3. הוסף דגימה של 2 μL של cDNA או פלסמיד לתערובת PCR בסיבוב הראשון בתוך תחנת עבודה PCR בחדר תבניות. הבקרה החיובית PCR היא CVS-11 cDNA מוכן כאמור בשלב 1.3 עבור שיטת RT לעיל. הבקרה השלילית PCR היא dd H₂O.
4. העבר את הצינורות האטומים למחזור תרמי PCR ומחזור באמצעות הפרמטרים המפורטים בטבלה 3.

3. PCR סיבוב שני

1. הכינו את תערובת ה-PCR של הסיבוב השני בצינור PCR של 0.2 מ"ל באמצעות הריאגנטים המפורטים בטבלה 4.
2. הוסף 2 μL של מוצר PCR סיבוב ראשון לתמהיל PCR סיבוב שני. בנוסף, כלול dd H₂O כשליטה שלילית של PCR סיבוב שני.
3. בצע מחזור תרמי PCR באמצעות אותם פרמטרים כפי שניתן בשלב 2.4.

טבלה 1: ריאגנטים של שעתוק לאחור עבור סינתזת cDNA.

רכיב	נפח לתגובה (μl)
dNTPs (2.5 mM )	4
פריימר אקראי (50 מיקרומטר)	1.5
אוליגו(dT) 15 (50 מיקרומטר)	0.5
מאגר M-MLV (פי 5)	4
M-MLV שעתוק הפוך (200 IU/μL)	1
RNasin (40 IU/μL)	1
עוצמת קול כוללת	12

טבלה 2: ריאגנטים של PCR סיבוב ראשון.

רכיב	נפח לתגובה (μl)
dNTPs (10 mM)	1
אקס-טאק (5 U/μL)	0.3
Taq Buffer (פי 10)	5
N127 (20 מיקרומטר)	1
N829 (20 מיקרומטר)	1
dd H2O	39.7
עוצמת קול כוללת	48

טבלה 3: פרמטרים מחזוריים של PCR סיבוב ראשון ושני

טמפרטורה	זמן	מחזור
94°C	2 דקות	1
94°C	30 שניות	35
56 °C	30 שניות	35
72 °C	40 שניות	35
72 °C	10 דק'	1
4 °C	∞

טבלה 4: ריאגנטים של ה-PCR בסיבוב השני.

רכיב	נפח לתגובה (μl)
dNTPs (10 mM)	1
אקס-טאק (5 U/μL)	0.3
Taq Buffer (פי 10)	5
N371F (20 מיקרומטר)	1
N371R (20 מיקרומטר)	1
dd H2O	39.7
עוצמת קול כוללת	48

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
ddH2O	מגוון	מגוון
dNTPs (10 mM)	טאקארה	4019
dNTPs (2.5 mM)	טאקארה	4030
אקס-טאק (5 U/μL)	טאקארה	$001
צינורות מיקרוצנטריפוגות	מגוון	מגוון
M-MLV שעתוק הפוך (200 IU/μL)	טאקארה	2641א
אוליגו (dT)15	טאקארה	3805
מכונת PCR	ביו-ראד	T100
צינורות PCR	מגוון	מגוון
פיפטורים	מגוון	מגוון
פריימר אקראי	טאקארה	3801
מעכב RNase (40 IU/μL)	טאקארה	2313א
ddH ללא RNase2O	טאקארה	9102
Taq Buffer (פי 10)	טאקארה	9152א
טיפים	מגוון	מגוון
מערבל מערבולות	מגוון	מגוון