מאמר שיטה

PCR נמס ברזולוציה גבוהה לקביעת וריאציות רצף ברצפי DNA מוטנטיים

8 ביולי 2025

במאמר זה

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מקור: Kisserli, A., et al. PCR נמס ברזולוציה גבוהה עבור קולטן משלים 1 אורך פולימורפיזם גנוטיפ: כלי חדשני להערכת רגישות גנים למחלת אלצהיימר. J. Vis. Exp. (2017).

בסרטון זה, אנו מתארים טכניקת PCR התכה ברזולוציה גבוהה כדי לקבוע את פולימורפיזם האורך של מקטעי DNA באורכי רצף משתנים, בהתבסס על ניתוח טמפרטורת התכה.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. פרוטוקול HRM-PCR

  1. הפשירו את דגימות הדנ"א. לדלל את דגימות ה- DNA בצינורות 1.5 מ"ל עם מים כדי להתאים אותם לריכוז של 10 ng/μL
    הערה: הנפח הכולל של DNA מדולל צריך להיות בין 2 μL ו 10 μL.
  2. הפשירו את פתרונות הפריימר. לדלל את תמיסות הפריימר בצינורות 1.5 מ"ל עם מים כדי להתאים אותם לאותו ריכוז של 6 μM.
    הערה: רצפי הפריימר ותנאי התגובה מוצגים בטבלה 1.
  3. הפשירו את פתרונות ערכת HRM-PCR וערבבו בזהירות על ידי מערבולות כדי להבטיח את ההתאוששות של כל התכולה. סובבו בקצרה את שלושת הבקבוקונים המכילים את התערובת האנזימטית עם צבע קושר DNA, MgCl2, ומים במיקרוצנטריפוגה לפני פתיחתם. אחסנו אותם בטמפרטורת החדר.
  4. בצינור של 1.5 מ"ל בטמפרטורת החדר, הכינו את תערובת ה-PCR לתגובה אחת של 20 מיקרוליטר על ידי הוספת הרכיבים הבאים בסדר המפורט להלן:
    1. 10 μL של תערובת אנזימטית עם צבע מחייב DNA;
    2. 2 μL של 25 mM MgCl2;
    3. 1 μL של פריימר 1, 6 מיקרומטר (ריכוז סופי: 300 nM);
    4. 1 μL של פריימר 2, 6 מיקרומטר (ריכוז סופי: 300 nM); וכן
    5. 5 מיקרוליטר מים.
      הערה: כדי להכין את תמהיל ה-PCR ליותר מתגובה אחת, הכפל את אמצעי האחסון לעיל במספר התגובות שיש להפעיל, בתוספת תגובה אחת נוספת.
  5. מערבבים בזהירות על ידי מערבולת.
  6. פיפטה 19 μL של תערובת PCR, מוכן לעיל, לתוך כל באר של צלחת multiwell לבן.
  7. הוסף 1 μL של תבנית DNA מותאמת ריכוז.
    הערה: עבור תגובות בקרה, הפעל תמיד בקרה שלילית עם הדגימות. כדי להכין בקרה שלילית, החלף את הדנ"א של התבנית במים.
  8. אטמו את הצלחת הלבנה עם נייר איטום.
  9. מניחים את צלחת המולטיוול הלבנה בצנטריפוגה ומאזנים אותה עם משקל נגד מתאים (כלומר, צלחת רב-באר נוספת). צנטריפוגה למשך דקה אחת במהירות של 1,500 x גרם בצנטריפוגת דלי נדנדה סטנדרטית המכילה רוטור ללוחות מרובי בארות עם מתאמים מתאימים.
  10. טען את הצלחת הלבנה מרובת הבארות במכשיר HRM-PCR.
  11. הפעל את תוכנית HRM-PCR עם תנאי ה- PCR הבאים:
    דנטורציה: 95 °C למשך 10 דקות; מחזור אחד.
    הגברה: 95 ° C עבור 10 שניות, 62 ° C עבור 15 שניות, ו 72 ° C עבור 20 שניות; 47 מחזורים.
    עקומת התכה: 95 °C; קצב רמפה: 0.02 °C/s; 25 רכישות ל-°C; מחזור אחד.
    קירור: 40 °C למשך 30 שניות; קצב רמפה 2.2 ° C / s; מחזור אחד.

figure-protocol-1

טבלה 1: פריימרים ופרמטרים המשמשים בניתוח התכה ברזולוציה גבוהה.

2. ניתוח HRM לקביעת פולימורפיזם אורך CR1

הערה: המתודולוגיה המתוארת (איור 1) היא ספציפית לתוכנה שלנו (ראה טבלת חומרים), אם כי ניתן להשתמש בחבילות תוכנה אחרות.

  1. פתח תוכנה לסריקת גנים כדי לבצע את ניתוח סריקת פולימורפיזם באורך CR1.
  2. פתח את הניסוי המכיל את תוכנית ההגברה ואת תוכנית עקומת ההיתוך.
  3. לחץ על עורך דוגמאות בסרגל מודול ולאחר מכן בחר את זרימת העבודה סריקה.
  4. הגדר את המאפיינים של הדגימות (כלומר, שם; לא ידוע או שלילי).
  5. לחץ על ניתוח בסרגל המודול.
  6. ברשימה יצירת ניתוח חדש, בחר סריקת גנים.
  7. לחץ על הכרטיסיה נורמליזציה כדי לנרמל את עקומות ההיתוך.
  8. לחץ על הכרטיסיה שינוי טמפרטורה כדי לאפס את ציר הטמפרטורה (ציר x) של עקומות ההתכה.
    הערה: הגרף התחתון מציג עקומות התכה שהן גם מנורמלות וגם מוסטות טמפרטורה.
  9. לחץ על הלחצן חשב כדי לנתח את התוצאות ולקבוע את הקיבוץ.
  10. לחץ על הכרטיסיה התוויית הפרשים באזור תרשימים כדי להציג את עקומות ההתכה המנורמלות והמוזזות ואת התוויית ההפרש מנורמל והוסט טמפרטורה.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

figure-results-1
איור 1: צילומי מסך של הממשק הגרפי של התוכנה שנעשה בה שימוש בשלב 2 של הפרוטוקול. (A) פתח את תוכנת סריקת הגנים. (B) תוכנית הגברה ותוכנית עקומת התכה. (C) לחץ על עורך לדוגמה בסרגל המודול. (ד) בחר סריקה. (ה) הגדר את המאפיינים של הדגימות. (F) לחץ על ניתוח בסרגל המודול.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
לא הוכרז על ניגוד עניינים.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
מעיל מעבדההגנה
כפפות מבחן ניטריל ללא אבקה של SensiCareIceMedline Industries, Inc, מונדליין, IL 60060, ארה"ב486802הגנה לדוגמה
Eppendorf ייחוס 2 פיפטה, 0.5-10μLEppendorf France SAS, F-78360 Montesson, צרפת4920000024פיפטינג לדוגמה
Eppendorf ייחוס 2 פיפטה, 20-100μLEppendorf France SAS, F-78360 Montesson, צרפת4920000059פיפטינג לדוגמה
Eppendorf ייחוס 2 פיפטה, 100-1000μLEppendorf France SAS, F-78360 Montesson, צרפת4920000083פיפטינג לדוגמה
TipOne 10μL מדורג, קצה מסנןStarlab GmbH, D-22926 Ahrenburg, גרמניהS1121-3810פיפטינג לדוגמה
TipOne 1-100μL משופע, קצה מסנן Starlab GmbH, D-22926 Ahrenburg, גרמניהS1120-1840פיפטינג לדוגמה
ART 1000E קצה מחסוםThermo Fischer scientific , F-67403 Illkirch, צרפת2079הפיפטינג לדוגמה
צינורות Eppendorf לנעילה בטוחה, 1.5 מ"ל, איכות EppendorfEppendorf France SAS, F-78360 Montesson, צרפת30120086לערבב
וורטקס-ג'יני 2Scientific Industries, Inc, בוהמיה, ניו יורק 111716, ארה"ב (ארצות הברית)ת"י 0236לערבב
מיקרו 200 צנטריפוגהHettich Zentrifugen, D-78532, גרמניה0002020-02-00צנטריפוגה
Multipette E3Eppendorf France SAS, F-78360 Montesson, צרפת4987000010הפצה
Light Cycler 480 Multiwell צלחת 96, לבןRoche Diagnostics GmbH, D-68305 מנהיים, גרמניה4729692001מקום תגובה
רדיד איטום Light Cycler 480Roche Diagnostics GmbH, D-68305 מנהיים, גרמניה4429757001כיסוי
LightCycler 480 Instrument II, 96-wellRoche Diagnostics GmbH, D-68305 מנהיים, גרמניה05015278001תגובת שרשרת פולימראז נמס ברזולוציה גבוהה
Heraeus Megafuge 11R צנטריפוגהThermo Fischer scientific , F-67403 Illkirch, צרפת75004412צנטריפוגה
LightCycler 480 מאסטר התכה ברזולוציה גבוההRoche Diagnostics GmbH, D-68305 מנהיים, גרמניה04909631001ריאגנטים של תגובה
פריימר CN3: 5'ggccttagacttctcctgc 3'Eurogentec Biologics Division, B4102 Seraing, בלגיהמגיב תגובה
פריימר CN3re: 5'gttgacaaattggcggcttcg 3'Eurogentec Biologics Division, B4102 Seraing, בלגיהריאגנטים של תגובה
אור cycler 480 SW 1.5.1 תוכנהRoche Diagnostics GmbH, D-68305 מנהיים, גרמניהתוכנה המשמשת לניתוח נתוני פולימורפיזם HRM-PCR CR1

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

DNAPCRDNACR1

מאמרים קשורים