תגובת שרשרת של Multiplex Droplet Polymerase לזיהוי מתילציה של DNA בלויקוציטים

תקציר

מקור: Malic, L., et al. Methylation Specific Multiplex Droplet PCR באמצעות מכשיר מחולל טיפות פולימרי לאבחון המטולוגי.J. Vis. Exp. (2020)

סרטון זה מדגים את טכניקת תגובת השרשרת של פולימראז טיפות מרובות לכימות סימולטני של אזורי DNA מתילציה באוכלוסיות תאי דם לבנים שונות כסמן ביולוגי מוקדם לאבחון קליני ופרוגנוזה.

פרוטוקול

1. יצירת טיפות ו-PCR

הערה: טבלה 1 מתארת מידע על פריימרים קדימה ואחורה יחד עם בדיקות הידרוליזה מרוות כפולה עבור הגנים C-LESS, CD3Z ו- Foxp3, הנדרשים להגברה מרובת המולטיפלקסים של מטרות גנים שעברו דה-מתילציה.

1. הכן את תערובת האב כמתואר בטבלה 2.
2. הפשירו את כל מרכיבי תערובת האב למעט תערובת האנזימים. מערבבים היטב את תערובת המאסטר על ידי פיפטציה מעלה-מטה, ומסובבים מטה לזמן קצר.
3. הוסף את הנפח המתאים (1 μL) של DNA מומר ביסולפיט לתערובת האב בצינור PCR. ערבבו את התגובה על ידי פיפטציה מעלה-מטה וסחרור מטה לזמן קצר.
4. חבר צינורות נוזלים חד פעמיים (ת.ז. 0.25 מ"מ, קוטר חיצוני 1.6 מ"מ) לשני מזרקי זכוכית מדויקים (נפח 250 מיקרוליטר) באמצעות אביזרי PEEK.
5. מלאו מזרק זכוכית מדויק אחד ב-250 מיקרוליטר שמן נשא המכיל 5% פלואורו-פעילי שטח.
6. מלאו מזרק זכוכית מדויק נוסף ב-50 מיקרוליטר שמן נשא לפני טעינת 100 מיקרוליטר של תערובת ה-PCR כדי להבטיח ניפוק של כל נפח הדגימה במהלך התחלוב.
7. הגדר מכשיר מיקרופלואידי טיפתי על במה של מיקרוסקופ אור זקוף המצויד במצלמה במהירות גבוהה כדי לצפות ולתעד היווצרות טיפות בזמן אמת.
8. הניחו את המזרקים הממולאים מראש על משאבת המזרק הניתנת לתכנות ובאמצעות איחוד PEEK עם אביזרים (ראו טבלת חומרים), חברו את הצינורית של המזרקים לצינורות של תעלות הכניסה המתאימות של המכשיר המיקרופלואידי הטיפתי.
9. מקם את הצינור מהשקע של מחולל הטיפות בתוך צינור PCR של 0.5 מ"ל.
10. התאימו את קצב הזרימה של משאבת המזרק ל-2 מיקרוליטר/דקה ואפשרו לגודל הטיפה להתייצב לפני איסוף התחליב שנוצר.
11. לאסוף את תחליב ולהעביר 75 μL לצינור PCR 0.2 מ"ל עבור מחזור תרמי.
12. ודא שתכולת השמן בצינור ה-PCR תואמת היטב את נפח הפאזה המפוזרת על מנת למנוע התלכדות של הטיפות במהלך מחזור תרמי.
13. הניחו את צינור ה-PCR בנפח 0.2 מ"ל במחזור תרמי ובצעו את פרוטוקול המחזור באופן הבא: חימום מקדים ב-95°C למשך 5 דקות, לאחר מכן 45 מחזורי דנטורציה ב-95°C למשך 15 שניות, וחישול/הארכה ב-60°C למשך 30 שניות.

טבלה 1: תכנון בדיקות פריימר והידרוליזה.

FOXP3 קדימה	GGG TTT TGT TGT TAT AGT TTT TG
FOXP3 הפוך	TTC TCT TCC TCC ATA ATA TCA
CD3Z קדימה	GGA TGG TTG TGG TGA AAA GTG
CD3Z הפוך	CAA AAA CTC CTT TTC TCC TAA CCA
C-LESS קדימה	TTG TAT GTA TGT GAG TGT GGG AGA GA
C-LESS הפוך	TTT CTT CCA CCC CTT CTC TTC C
בדיקת FOXP3	/56-FAM/CA ACA CAT C/ZEN/C AAC CAC CAT /3IABkFQ/
בדיקת CDZ3	/56-HEX/CC AAC CAC C/ZEN/A CTA CCT CAA /3IABkFQ/
גשושית ללא C	/56-CY5/CT CCC CCT C/ZEN/T AAC TCT AT/3IABkFQ/

טבלה 2: מתכון מאסטר למיקס עבור mdPCR.

מגיב	פתרון מלאי	נפח מיקס מאסטר	ריכוז עבודה
Tris-HCl	1 מטר	2 μL	20 מ"מ
KCl	1 מטר	10 מיקרוליטר	100 מ"מ
MgCl2	25 מ"מ	16 מיקרוליטר	4 מ"מ
פריימרים C-LESS	10 מיקרומטר	10 מיקרוליטר	1 מיקרומטר כל אחד
פריימרים CD3Z	10 מיקרומטר	10 מיקרוליטר	1 מיקרומטר כל אחד
פריימרים FOXP3	10 מיקרומטר	10 מיקרוליטר	1 מיקרומטר כל אחד
גשושית C-LESS	10 מיקרומטר	5 מיקרוליטר	500 נאנומטר
בדיקת CD3Z	10 מיקרומטר	5 מיקרוליטר	500 נאנומטר
בדיקת FOXP3	10 מיקרומטר	5 מיקרוליטר	500 נאנומטר
HotStarTaq DNA פולימראז	5 יחידות/μL	8 מיקרוליטר	0.4 יחידות/μL
יעד DNA שטופל בביסולפיט	משתנה	משתנה	משתנה
מים ללא Nuclease		משתנה
נפח כולל		100 מיקרוליטר

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
צינור PCR	Bio-Rad, מיסיסוגה, ON	TFI0201
פלואורו-פעילי שטח	רן ביוטכנולוגיות, בוורלי, מסצ'וסטס	008-פלואורופעילי שטח
צינורות נוזלים חד פעמיים	דולומיט	3200063
צינורות נוזלים חד פעמיים	דולומיט	3200302
אביזרי הצצה	IDEX בריאות ומדע, אוק הארבור, WA	P-881
שמן נשא	3M , סנט פול, מינסוטה
מיקרוסקופ אור זקוף	Nikon, Melville, NY