$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
1. בקרת איכות של DNA גנומי
הערה: DNA גנומי (gDNA) הופק מדם היקפי באמצעות שיטת טיהור DNA מבוססת סיליקה מבוססת קרום סיליקה. לפני ההליכים הבאים, ריכוז gDNA נקבע באמצעות ספקטרופוטומטר.
- הכינו את דגימת ה-gDNA בריכוז של 10-100 ננוגרם/מיקרוליטר.
- הוסף 10 μL של מאגר דגימת DNA לרצועה של 8 צינורות.
- הוסף 1 μL של סולם DNA או gDNA לצינורות. מערבבים את התערובת במשך דקה אחת באמצעות חיבור microplate.
- טען את הצינור, מכשיר הג'ל וקצות פיפטה לתוך מכשיר האלקטרופורזה (טבלה של חומרים) והתחל את הריצה על ידי לחיצה על כפתור 'התחל'.
הערה: מערכת האלקטרופורזה תפעל באופן אוטומטי בלחיצה אחת על כפתור התחל.
- ודא שהסמן התחתון הכלול במאגר דגימת ה- DNA מוקצה כראוי באלקטרופרוגרמות. אם הוא מוקצה באופן שגוי, הקצה ידנית את הסמן במצב 'Electroherogram' של התוכנה.
הערה: מספר שלמות ה- DNA (DIN) יחושב באופן אוטומטי. ערך ה-DIN מגיע משלמות ה-DNA. ערכי DIN גבוהים ונמוכים מצביעים על gDNA תקין מאוד ופגום מאוד, בהתאמה.
- ציין את אזור הגודל של gDNA (> 200 bp) במצב 'אזור' של התוכנה כדי לחשב באופן אוטומטי את ריכוז gDNA (> 200 bp).
2. פריימר ועיצוב בדיקה
- חשב את ערכי טמפרטורת ההתכה (Tm) באמצעות כל כלי גישה פתוחה בתנאים הבאים: 10-25 בסיסים, 50 mM Na+/K+ , 0.80 mM dNTPs ו- 3 mM Mg2+ (רשימת חומרים). תכנן את הפריימרים קדימה ואחורה כדי להגביר את האזור הגנומי המכיל אללי מטרה עם ערךT m סביב 60 ° C ואורך אמפליקון ב 100-300 bp.
הערה: עיין בטבלה 1 לריכוז אוליגונוקלאוטידים.
- תכנן את בדיקות חומצת הגרעין הנעולה (LNA) עבור אללי הייחוס והגרסאות בהתבסס על התנאים הבאים: (i) 1-6 LNA נמצאים בכל בדיקה; (2) צבע פלואורסצנטי ומרווה נמצאים ב-5 ו-3 אינץ' של כל בדיקה, בהתאמה; (iii) ההפרש בין ערכי Tm של הגשושיות התואמות והלא תואמות הוא > 10°C; (iv) ערכי Tm של הגשושיות התואמות והלא תואמות גבוהים ונמוכים מאלה של הפריימרים, בהתאמה [לדוגמה, פריימר קדמי: 60.8 °C, פריימר הפוך: 59.8 °C, בדיקת אלל ייחוס (תואם/לא תואם): 62.6/45.3 °C, בדיקת אלל משתנה (תואם/לא תואם): 61.7/50.5 °C]. ערכי Tm חושבו באמצעות כלי הגישה הפתוחה המשמש גם לשלב 2.1.
- ודא שהפריימרים והגשושיות המתוכננים אינם מקיפים את פולימורפיזמים הנוקלאוטידים הבודדים בתדירות של > 0.1% כפי שנקבע ממסדי נתונים [לדוגמה, מסד הנתונים של פולימורפיזם נוקלאוטיד יחיד (dbSNP)].
3. PCR דיגיטלי
- הכינו את הפריימרים, הגשושיות ותמיסות מלאי gDNA בריכוזים המתוארים בטבלה 1 עם מאגר TE ואחסנו אותם בטמפרטורה של -20–4°C.
- מערבבים את הריאגנטים בטמפרטורת החדר בנפח כולל של 15 μL לריכוז סופי כמתואר בטבלה 1.
- הוסף 3 μL של מים מזוקקים במקום gDNA בפקד ללא תבנית (NTC).
- הכינו פי 3.5 מכמות תערובת ה-PCR בשילוש כדי לקחת בחשבון את שגיאת הפיפט.
- פיפטה את תערובת PCR למעלה ולמטה כדי לערבב אותו.
- הגדר את פלטפורמת הטעינה על השבבים המובנים ברצועת 8 הצינורות, והגדר אותם על הטוען האוטומטי. ודא שיש מגע בין השבב לבין פלטפורמת הטעינה.
- הכנס מחוון טעינה על הרציף והחזק את המחוון עם הפקק מחוץ למטעין.
- פיפטה 15 μL של תערובת PCR על הפלטפורמה ליד קצה המחוון (איור 1A).
- הפעל את המטעין על ידי לחיצה על כפתור המטעין (למשך כדקה).
הערה: זו לא בעיה אם כמות קטנה של תערובת PCR נשארת על הפלטפורמה. ניתן להפעיל מחדש ברצף את המטעין.
- מקמו את השבב בצינור המלא בתערובת PCR בחריץ הצדדי של משפר האיטום. דחפו את מכסה ההחלקה ואת קצה המכסה העליון כדי לא לשבור את השבב (איור 1B).
- הפעל את משפר האיטום (כ -2 דקות). הפעילו מחדש את משפר האיטום ברצף למשך דקה אחת אם שלולית נוזלים עדיין נראית לעין, מאחר שאיטום לא שלם גורם לזיהום צולב של האותות החיוביים (איורים 1C ו-1D).
- הוסף 230 μL של נוזל איטום, מגיב על בסיס שמן, לצינורות.
הערה: השבבים צריכים כעת להיות שקועים בנוזל.
- הגדר את הצינורות במחזור התרמי. הפעל את המחזור התרמי כמתואר בטבלה 2 (למשך כשעתיים). כוונן את הטמפרטורה או את משך הזמן של PCR אם יש התפלגות לא אחידה של מחיצות חיוביות (איור 1E).
הערה: מומלץ לכוון את קצב הרמפה לסביבות 1 ° C / s.
- השאר את הצינורות במחזור התרמי למשך 15 דקות לפחות כדי להפחית את הרעש הבסיסי.
הערה: ניתן להשאיר את הצינורות גם למשך הלילה. אותות פלואורסצנטיים זוהו כבר למחרת.
- הניחו את הצינורות על ג'יג הגילוי ושפכו 6 מ"ל מים מזוקקים לתוך הג'יג. אם בועות אוויר נראות בתוך הצינוריות ומחוצה להן, נקו אותן (איורים 1F ו-1G).
- טען את הגלאי והפעל אותו בלחיצה על כפתור 'הפעלה' של התוכנה לאחר בחירת כרטיסיות Fluorescence, Experiment ו- Sample/NTC (Table of Materials).
הערה: זיהוי הצבע הכפול של שמונה דגימות בעוצמת ברירת מחדל אורך כ- 4 עד 5 דקות.
- אשר את התוויית המיקום, ההיסטוגרמה והתוויית הפיזור הדו-ממדית.
הערה: אם עוצמת הפלואורסצנטיות של המחיצות השליליות גבוהה, התאם את העוצמה בלחיצה על כפתור ההגדרות של התוכנה כך שהיא תיפול בטווח של 30-70.
- חשב את שבר האלל המשתנה (VAF) באמצעות הנוסחה הבאה:
כאן, Cv ו- Cr הם מספרי ההעתק של הגרסה ואלל הייחוס, בהתאמה.
הערה: הם מחושבים באופן אוטומטי בתוכנה בהתבסס על סטטיסטיקה פואסון.
4. איסוף מוצרי PCR
- מוציאים את נוזל האיטום מהשפופרת.
- הוסף 100 μL של חיץ TE לצינור. מערבלים במרץ במשך 30 שניות וצנטריפוגות קצרות את הצינור.
- מעבירים את תמיסת TE לצינור אחר ומוסיפים 30 μL של 3 M נתרן אצטט ו 200 μL אתנול.
- מצננים את התמיסה בטמפרטורה של -20°C למשך הלילה.
- צנטריפוגו את התמיסה למשך 30 דקות ב 16,000 x גרם ולהסיר את supernatant.
- הוסף 300 μL של 80% אתנול לצינור ולמערבולת.
- צנטריפוגו את התמיסה למשך 15 דקות ב 16,000 x גרם ולהסיר את supernatant. הניחו לשקע להתייבש באוויר למשך 5 דקות.
- יש להמיס את המשקע ב-1-5 μL של חיץ TE לאחר ייבוש באוויר.
- במידת הצורך, הערך את גודל המוצר באמצעות מכשיר אלקטרופורזה תוך התייחסות לשלב 1. טען 1 μL של התמיסה למכשיר הג'ל לרגישות גבוהה (טבלה של חומרים).
