$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
כל ההליכים המערבים משתתפים אנושיים בוצעו בהתאם להנחיות המוסדיות, הלאומיות והבינלאומיות לרווחת האדם ונבחנו על ידי ועדת הבדיקה המוסדית המקומית.
הערה: הליך זה תוכנן במיוחד לזיהוי מספר נמוך של מולקולות cDNA ברקמות טריות קפואות אנושיות. חלקי הרקמה נחתכו על קרח יבש, בעודם קפואים, מגידול קיבה שאומת בעבר על ידי המטופל או מדגימות רקמה רגילות.
1. בידוד וטיהור RNA
- מיצוי RNA
הערה: בידוד RNA מתבצע מתחת למכסה המנוע באמצעות מוצר ספציפי (ראה טבלת חומרים). עם זאת, מגוון ערכות בידוד זמינות מסחרית.
- הומוגניזציה 50 - 100 מ"ג של דגימת רקמה טרייה קפואה חתוכה דק בצינור 1.5 מ"ל עם 1 מ"ל של מגיב בידוד RNA מערבולת במרץ במשך 15 שניות. לדגור את הצינורות ב -80 ° C לילה.
- לדגור על הצינור המכיל את הדגימה בטמפרטורת החדר במשך 5 דקות ולערבב על ידי מערבולות במשך 15 שניות.
- שמור את הצינור על קרח, להוסיף 200 μL של כלורופורם, מערבלים במרץ במשך 15 שניות.
- לדגור על הצינורות בטמפרטורת החדר במשך 60 שניות ולצנזר אותם ב 12,000 x גרם במשך 15 דקות ב 4 ° C.
- מעבירים את הפאזה המימית לצינור של 1.5 מ"ל ומוסיפים 20 מיקרוגרם גליקוגן.
הערה: חשוב להימנע בזהירות מהעברת כל אחת מהשכבות הבין-פאזיות או האורגניות על מנת להפחית את הזיהום.
- מוסיפים 500 μL של איזופרופנול, הופכים את הצינור לערבוב, ודגרים על קרח למשך 10 דקות.
- צנטריפוגה את הצינור ב 12,000 x גרם במשך 15 דקות ב 4 ° C כדי לזרז RNA.
הערה: RNA יהיה נוכח בכדורית דמוית ג'ל בצד ובתחתית הצינור, לעתים קרובות בלתי נראית לאחר צנטריפוגה.
- הסר את supernatant מבלי להפריע את המשקע ולשטוף אותו עם 1 מ"ל של אתנול 75% על ידי pipetting.
- צנטריפוגה את הצינור ב 7,500 x גרם במשך 5 דקות ב 4 ° C ולהסיר את supernatant מבלי להפריע את הכדור.
- תן לגלולה להתייבש עד שהמשקע הופך שקוף והמיס אותו ב 50 μL של מים נטולי RNase.
- יש להקפיא את הדגימות בטמפרטורה של -80°C לפחות למשך הלילה לפני הכימות.
- חיסול DNA גנומי וטיהור RNA
הערה: שלב עיכול DNase, ואחריו טיהור RNA מבוסס עמודה, מומלץ לניתוח מטרות בשפע נמוך על מנת לעכל DNA מזהם.
- ממיסים את ה-DNase I (1,500 יחידות קוניץ) ב-550 מיקרוליטר מים נטולי RNase באמצעות מזרק, מערבבים בעדינות על ידי היפוך הבקבוקון, ומחלקים את תמיסת המלאי המשוחזרת לאליציטוטים.
- העבירו בצינור של 1.5 מ"ל את הנפח המחושב של הדגימה עם 15 מיקרוגרם RNA, 10 מיקרוליטר של מאגר עיכול DNase מהערכה (המופיע בטבלת החומרים), 2.5 מיקרוליטר של תמיסת מלאי DNase I, ומים נטולי RNase ל-100 מיקרוליטר. דגרו בטמפרטורת החדר למשך 10 דקות.
- מוסיפים 350 μL של חיץ ליזיס רקמות (מהערכה, ראו טבלת חומרים) ומערבבים על ידי פיפטינג.
- מוסיפים 250 μL של 100% אתנול ומערבבים על ידי pipetting.
- העבר את כל הנפח (700 μL) לעמוד ספין וצנטריפוגה חדשים במהירות של 12,000 x גרם למשך 15 שניות.
- מעבירים את המסנן לצינור איסוף חדש, מוסיפים 500 μL של 80% אתנול לעמודה, וצנטריפוגה ב 12,000 x גרם למשך 2 דקות.
- פתח את מכסה עמוד הסחיטה והצנטריפוגה במהירות של 12,000 x גרם למשך 5 דקות באמצעות צינור איסוף חדש לייבוש המסנן; ולאחר מכן העבר את המסנן לצינור של 1.5 מ"ל.
- הוסף 14 μL של מים נטולי RNase ישירות לעמוד המסנן ולצנטריפוגה ב 12,000 x גרם למשך דקה אחת.
- שמור את הדגימות על קרח והמשך לכימות באמצעות 2 μL של הדגימה על ספקטרופוטומטר עליון או לאחסן את הרנ"א ב -80 ° C עד לשימוש.
2. הגדרת תגובת PCR דיגיטלית
- תמהיל תגובת dPCR והכנת דגימה
- הפשירו את תערובת המאסטר ואת הבדיקה בטמפרטורת החדר למשך 20 דקות לפחות.
- לדלל את דגימות cDNA לריכוז של 300 ng ב 6 μL של מים.
- מערבבים בעדינות את תערובת האב ומכינים את התערובת בצינור סטרילי עם 8.7 μL של תערובת מאסטר, 0.87 μL של פריימר בדיקה מותאם אישית CDH1a, ו 1.83 μL של מים נטולי nuclease עבור נפח סופי של 11.4 μL.
הערה: לפרטים על פריימר בדיקה בעיצוב מותאם אישית של CDH1a, עיין בטבלת החומרים.
- מעבירים 11.4 μL מהתערובת המוכנה לדגימת cDNA מדוללת, מערבבים בעדינות וצנטריפוגות קצרות.
הערה: נפחים כוללים עודף של 20% כדי לפצות על אובדן נפח מצנרת. הכן את התמהיל עבור כל הדגימות ופקד ללא תבנית (NTC).
- הכנת שבב
הערה: לקבלת תוצאות מיטביות, טען את השבבים בהקדם האפשרי.
- חבר את טוען השבבים והמתן עד שנורית החיווי תהפוך לירוקה.
- הסר את המכסה של מזרק נוזל טבילה על ידי משיכת בעדינות לאחור את הבוכנה 1 - 2 מ"מ ושחרורו כדי להקל על צעד זה, ולהחליף אותו עם קצה.
- קח שבב חדש ושים לב לקוד שנכתב על המכסה כדי לשייך אותו לדגימה.
- החזיקו את המכסה בזהירות על צדו, קלפו את סרט המגן והניחו את המכסה עם הפנים הדביקות כלפי מעלה בכיוון הנכון.
- בזהירות להרים שבב, נזהר לא לגעת בחלק הפנימי, ולטעון אותו על קן השבבים במיקום הנכון על ידי לחיצה על הידית כדי לפתוח את המהדק.
- טען להב טעינה חדש על המעמיס ודחוף אותו בעדינות כדי להבטיח שהוא יציב במקומו.
- העבר 14.5 μL של תערובת התגובה dPCR על להב הטעינה מבלי ליצור בועות אוויר או להסיט את הלהב, ולאחר מכן לחץ על כפתור הטעינה השחור כדי להפיץ את עוצמת הקול על השבב.
- השתמש מזרק נוזל טבילה להעביר כ 20 טיפות על משטח השבב בזהירות לא לגעת במשטח עם קצה.
הערה: חשוב לכסות את כל המשטח מבלי לשפוך נוזל על הקצוות.
- סובב את זרוע המעמיס כדי שהמכסה יבוא במגע עם השבב ולחץ כלפי מטה במשך 15 שניות.
- לחץ על לחצן המכסה כדי לשחרר את השבב ולהחזיר את הזרוע למקומה.
- החזיקו את השבב המורכב בזווית של 45 מעלות ופזרו בזהירות את נוזל הטבילה עם המזרק דרך פתח המילוי, סובבו מעט את השבב כדי לוודא שאין בועות אוויר, והוציאו עודפי נוזלים עם מגבון סטרילי.
- אטמו את מארז השבב על ידי קילוף עדין של התווית מעל מכסה השבב ולחצו מעל פתח המילוי למשך 5 שניות לפחות.
- אחסן את השבב בחושך עד שיהיה מוכן לטעינה ב- Thermal cycler.
הערה: שבבים מוכנים יש להשתמש בתוך 2 שעות.
- תגובת dPCR
- פתח את המכסה והתקן את המתאמים לשני הבלוקים, גם כאשר נעשה שימוש בבלוק יחיד.
- מקם את השבבים על בלוק הדגימה במיקום הנכון.
הערה: יציאת המילוי חייבת להיות מכוונת לכיוון החלק הקדמי של המחזור התרמי במצב מוגבה כדי לאפשר לבועות אוויר לצוף למעלה מבלי להפריע לחלון השבב. השתמש בשבבים ריקים כדי לאזן את שני הבלוקים.
- הניחו את הכרית התרמית על בלוק הדגימה כדי לכסות לחלוטין את השבבים.
- סגור את המכסה והתחל את ריצת ה- PCR, תוך החלת התנאים הבאים: החזק ב- 96 ° C למשך 10 דקות; 45 מחזורים של 60 ° C למשך 2 דקות ו- 98 ° C למשך 30 שניות; החזק ב- 60 ° C למשך 2 דקות; החזק ב- 4 ° C. כבה את המחזור התרמי והפשיר את השבבים בטמפרטורת החדר למשך 10 דקות לפחות < / >
הערה: ניתוח שבבים חייב להתבצע תוך שעה.
- ניתוח שבבים
- פתח את מכסה המכשיר והסר את הרפידות התרמיות, ולאחר מכן הסר את השבבים מהמתאמים.
הערה: אחסנו את השבבים במקום חשוך ונקי עד לניתוח.
- נקו את משטח השבב עם איזופרופנול ומגבון סטרילי.
הערה: בדוק כל שבב לאיתור דליפות או בעיות פוטנציאליות.
- הכנס את ה- USB למערכת הגלאים כדי לשמור את הנתונים.
- פתח את מגש השבבים של מערכת הגלאי, טען את השבב עם הפנים כלפי מעלה במיקום הנכון ולאחר מכן סגור את המגש.
- המתן 30 שניות לעיבוד, ולאחר מכן הסר את השבב והכנס את הבא.
- המתן עד להשלמת הניתוח עבור כל השבבים המעובדים ולאחר מכן הכנס את ה- USB למחשב כדי להעביר את הקבצים.
הערה: הזמן הכולל לניתוח הוא סביב 2 עד 3 דקות / שבב.
3. ניתוח נתונים ופרשנות
- התחבר לפלטפורמת התוכנה מבוססת הענן הנדרשת לביצוע כל הניתוחים במורד הזרם.
- צור פרויקט וייבא את כל קבצי הנתונים של השבבים המעניינים.
- הזן את שם הדגימה; בחר את הצבע ואת הבדיקה המשמשים בכרטיסייה "הגדרת שבבים".
- קבע אם השבב מקובל על ידי הדמיה שלו בכרטיסייה "סקירת נתונים", בדיקת ביסודיות הדגימה נטענה על השבב וכמה נקודות נתונים ניתנות לביטול.
הערה: דחה שבבים עם פחות מ- 13,000 נקודות נתונים יקרות ערך.
- עבור לתרשים הפיזור של השבב שנבחר בצד ימין של המסך; החל סף של 6,000 עבור אותות הצבע של כתב הכתב פלואורסצאין (FAM) (ציר Y) על כל השבבים.
הערה: הגדרת הסף עשויה להשתנות בהתאם לבדיקות שבהן נעשה שימוש.
- הסר אותות חיוביים מפוקפקים כדי למנוע תוצאות חיוביות שגויות על-ידי בחירת הנקודה היחסית בתרשים הפיזור באמצעות הכלי לאסו ולחיצה על "לא נקבע". כל הכתמים החיוביים הנותרים מצביעים על נוכחות של עותקי cDNA של המטרה הנדירה שנותחה.