PCR דיגיטלי מבוסס שבב לזיהוי וריאנטים נדירים של תעתיק באמצעות שבב ננופלואידי

Abstract

מקור: Molinari, C., et al. איתור של וריאנט תעתיק נדיר CDH1 ברקמות סרטן קיבה קפואות טריות על ידי PCR דיגיטלי מבוסס שבב. J. Vis. Exp. (2018).

סרטון זה מדגים PCR דיגיטלי מבוסס שבב — וריאציה של טכניקת ה-PCR הדיגיטלית השימושית בזיהוי גרסאות תמלול נדירות. תגובת ה- PCR מחולקת לחדרים של שבב ננופלואידי, שכל אחד מהם פועל כתגובה עצמאית. זיהוי אותות פלואורסצנטיים מהתאים עם מטרות מוגברות מאשר את נוכחותם של וריאנטים נדירים של תעתיק בדגימה.

Protocol

כל ההליכים המערבים משתתפים אנושיים בוצעו בהתאם להנחיות המוסדיות, הלאומיות והבינלאומיות לרווחת האדם ונבחנו על ידי ועדת הבדיקה המוסדית המקומית.

הערה: הליך זה תוכנן במיוחד לזיהוי מספר נמוך של מולקולות cDNA ברקמות טריות קפואות אנושיות. חלקי הרקמה נחתכו על קרח יבש, בעודם קפואים, מגידול קיבה שאומת בעבר על ידי המטופל או מדגימות רקמה רגילות.

1. בידוד וטיהור RNA

1. מיצוי RNA
   הערה: בידוד RNA מתבצע מתחת למכסה המנוע באמצעות מוצר ספציפי (ראה טבלת חומרים). עם זאת, מגוון ערכות בידוד זמינות מסחרית.
   1. הומוגניזציה 50 - 100 מ"ג של דגימת רק....

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
מגיב טריאזול	תרמו פישר סיינטיפיק	15596018
גליקוגן 20 מ"ג/מ"ל	רוש	10901393001
ערכת ניקוי MinElute RNeasy	קיאגן	74204
ערכת סינתזת cDNA של iScript	BioRad	1708891
QuantStudio 3D דיגיטלי PCR מאסטר Mix v2	תרמו פישר סיינטיפיק	A26358
בדיקת CDH1a IDT בעיצוב מותאם אישית	טכנולוגיות DNA משולבות (IDT)	נה	F) GCTGCAGTTTCACTTTTAGTG (R) ACTTTGAATCGGGTGTCGAG (P)/FAM/CGGTCGACAAAGGACAGCCTATT/TAMRA/ [ריכוזי בדיקה ממוטבים dPCR: 900 ננומטר (F), 900 ננומטר (R), 250 ננומטר (P)]
ערכת שבב QuantStudio 3D Digital PCR 20K v2	תרמו פישר סיינטיפיק	A26316
Heraeus Biofuge Fresco	תרמו סיינטיפיק	75002402
Thermocycler (Labcycler)	סנסוקווסט	011-103
מערכת GeneAmp PCR 9700	תרמו פישר סיינטיפיק	N805-0200
מודול לדוגמה בלוק שטוח כפול	תרמו פישר סיינטיפיק	4425757
QuantStudio 3D בסיס הטיה עבור בלוק שטוח כפול GeneAmp PCR מערכת 9700	תרמו פישר סיינטיפיק	4486414
ערכת מתאם שבב PCR דיגיטלי תלת מימד QuantStudio עבור מחזור תרמי בלוק שטוח	תרמו פישר סיינטיפיק	4485513
QuantStudio 3D מטעין שבבי PCR דיגיטלי	תרמו פישר סיינטיפיק	4482592
מכשיר PCR דיגיטלי תלת ממדי QuantStudio עם כבל חשמל	תרמו פישר סיינטיפיק	4489084