$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
כל ההליכים המערבים משתתפים אנושיים בוצעו בהתאם להנחיות המוסדיות, הלאומיות והבינלאומיות לרווחת האדם ונבחנו על ידי ועדת הבדיקה המוסדית המקומית.
1. הכנת הציטוספינים
- הכינו שני ציטוספינים עם תאים חד-גרעיניים של דגימות המטופל (כלומר, ציטוספין אחד עבור צביעת γH2AX immunofluorescence וציטוספין אחד עבור γH2AX וצביעה אימונופלואורסצנטית משולבת של γH2AX ו-53BP1) באמצעות צנטריפוגה (300 x גרם, 10 דקות) של 1.0 x 105 תאים לכל תכשיר (איור 1 ו-2).
2. γH2AX ו- 53BP1 צביעת אימונופלואורסנציה
- קיבוע וחדירה: תקן את התאים עם 200 μL של 4% PFA למשך 10 דקות. לאחר הקיבוע, שטפו את התאים בעדינות שלוש פעמים עם 30 מ"ל PBS למשך 5 דקות כל אחד על שייקר מעבדה. לאחר מכן לחדור את התאים עם 200 μL של 0.1% Octoxinol 9 במשך 10 דקות. שטפו את התאים בעדינות שלוש פעמים עם 30 מ"ל של תמיסת חסימה של 5% למשך 5 דקות כל אחד על שייקר מעבדה. חסום את התאים ב 30 מ"ל של תמיסת חסימה טרייה של 5% למשך שעה אחת.
- דגירה עם נוגדנים
- לדגור על הכנה אחת של התאים עם נוגדן חד שבטי עכבר נגד γH2AX (1:500) ואת ההכנה השנייה של התאים עם נוגדן חד שבטי עכבר נגד γH2AX (1:500) ונוגדן ארנב רב שבטי נגד 53BP1 (1:500) לילה ב 4 ° C.
- לאחר הדגירה יש לשטוף את התאים בעדינות 3 פעמים עם 30 מ"ל של תמיסה חוסמת 2% לכל 5 דקות על שייקר מעבדה.
- הסר את תמיסת החסימה ודגור על ההכנה הראשונה של התאים עם נוגדן משני נגד עכבר עז מצומדת Alexa488 (1:500) וההכנה השנייה של התאים עם נוגדן משני נגד עכבר עז מצומד Alexa488 (1:500) ונוגדן משני נגד ארנב חמור מצומד Alexa555 (1:500) למשך שעה אחת בטמפרטורת החדר.
- אמצעי הרכבה: הניחו את המגלשה עם התאים בקערה ושטפו את התאים בעדינות שלוש פעמים עם 30 מ"ל PBS לכל 5 דקות על שייקר מעבדה. הסר את PBS ולהרכיב את התאים עם אמצעי הרכבה המכיל 4,6-diamidino-2-phenylindole. הניחו בזהירות מכסה על גבי אמצעי ההרכבה כך שלא יוטמעו בועות אוויר. המתן לפחות 3 שעות להתקשות המדיום ההרכבה לפני ניתוח התאים במיקרוסקופ פלואורסצנטי.
3. ניתוח מוקדי γH2AX ו- 53BP1
- מיקרוסקופ פלואורסצנטי: נתח את מוקדי γH2AX ו- 53BP1 בגרעיני התא באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי המצויד במסננים עבור DAPI, Alexa 488 ו- Cy3 במהלך הדמיה בהגדלה אובייקטיבית של פי 100. הקלט תמונות עם מצלמה ועבד את התמונות עם תוכנת הדמיה מתאימה.
