מיקרוסקופ אימונופלואורסנציה לניתוח שברים דו-גדיליים של DNA

תקציר

מקור: Popp, H. D., et al. Immunofluorescence Microscopy של γH2AX ו- 53BP1 לניתוח היווצרות ותיקון של שברים דו-גדיליים ב- DNA. J. Vis. Exp. (2017)

בסרטון זה, אנו מתארים את טכניקת המיקרוסקופ האימונופלואורסצנטי כדי לזהות חלבונים ספציפיים של תגובת נזק לדנ"א הממוקמים באתרים של שברים דו-גדיליים בדנ"א בתאים חד-גרעיניים אנושיים. החלבונים מזוהים על ידי נוגדנים ראשוניים ספציפיים, אשר בתורם נקשרים לנוגדנים משניים המתויגים בפלואורופור הפולטים פלואורסצנט במהלך הדמיה מיקרוסקופית, ומאפשרים הדמיה של החלבונים כמוקדים פלואורסצנטיים נפרדים בתוך גרעיני התא.

פרוטוקול

כל ההליכים המערבים משתתפים אנושיים בוצעו בהתאם להנחיות המוסדיות, הלאומיות והבינלאומיות לרווחת האדם ונבחנו על ידי ועדת הבדיקה המוסדית המקומית.

1. הכנת הציטוספינים

1. הכינו שני ציטוספינים עם תאים חד-גרעיניים של דגימות המטופל (כלומר, ציטוספין אחד עבור צביעת γH2AX immunofluorescence וציטוספין אחד עבור γH2AX וצביעה אימונופלואורסצנטית משולבת של γH2AX ו-53BP1) באמצעות צנטריפוגה (300 x גרם, 10 דקות) של 1.0 x 10⁵ תאים לכל תכשיר (איור 1 ו-2).

2. γH2AX ו- 53BP1 צביעת אימונופלואורסנציה

1. קיבוע וח....

תוצאות

איור 1: מכשיר להכנת הציטוספינים.

תרשים 2: הכנת הציטוספינים. שני ציטוספינים של כל דגימה מוכנים על ידי צנטריפוגה של 1.0 x 10⁵ תאים ב 300 x גרם במשך 10 דקות. ציטוספין אחד משמש לצביעת γH2AX immunofluorescence, וציטוספין אחר משמש לצביעה משולבת γH2AX ו- 53BP1 immunofluorescence.

....

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
שקופיות מיקרוסקופ אבחוני	תרמו סיינטיפיק	ER-203B-CE24	שקופיות מיקרוסקופ
Megafuge 1.0 R	הראיוס	75003060	צנטריפוגה שולחנית
מכשיר ציטוספין
המכסה	הראיוס	76003422	מכסה לעבודה ללא מיקרו-צינורות
מיכל Cyto	הראיוס	75003416	מיכל Cyto עם 2 משעמם חרוטי
מנשא קליפס	הראיוס	75003414	מנשא להחזקת מיכל ציטו ושקופית
הוספת תמיכה	הראיוס	75003417	עלון תמיכה להחזקת מנשא קליפס
פרפורמאלדהיד	סיגמא-אולדריץ'	עמ' 6148	סוכן קיבוע
מלח חוצץ פוספט	סיגמא-אולדריץ'	D8537	תמיסת מלח מאוזנת
Chemiblocker	מרק מיליפור	2170	סוכן חוסם
נוגדן חד-שבטי נגד γH2AX של עכבר (JBW301)	מרק מיליפור	05-636	נוגדן ראשוני לזיהוי γH2AX
נוגדן ארנב רב-שבטי נגד 53BP1 (NB100-304)	Novus Biologicals	NB100-304	נוגדן ראשוני לזיהוי 53BP1
Alexa Fluor 488-נוגדן עז מצומד נגד עכבר	Invitrogen	A-11001	נוגדן משני
Alexa Fluor 555-conjugated חמור נוגדן נגד ארנב	Invitrogen	A-31572	נוגדן משני
בינוני הרכבה Vectashield	מעבדות וקטוריות	H-1200	מכיל DAPI לצביעת DNA
Axio Scope.A1	זיס	490035	מיקרוסקופ פלואורסצנטי
Cool Cube 1 מצלמת CCD	מטא-מערכות	H-0310-010-MS	מערכת מצלמות להקלטה דיגיטלית
תוכנת Isis	מטא-מערכות	לא ישים	תוכנת מיקרוסקופ