העברה תוך ציסטרנלית של מנינגוקוק למודלים עכבריים כדי לגרום לדלקת קרום המוח מנינגוקוקית

תקציר

מקור: Pagliuca, C., et al., גרימת דלקת קרום המוח מנינגוקוקלית Serogroup C בעכברים באמצעות משלוח intracisternal. J. Vis. Exp. (2019)

בסרטון זה, אנו מדגימים את המסירה התוך-ציסטרנלית של Neisseria meningitidis לתוך מודל עכבר כדי ליצור זיהום דלקת קרום המוח.

פרוטוקול

כל הנהלים הנוגעים למודלים של בעלי חיים נבדקו על ידי הוועדה המוסדית המקומית לטיפול בבעלי חיים ועל ידי ועדת הבדיקה הווטרינרית JoVE.

1. הזרקה תוך חזה של עכברים

הערה: ההליך כולו מבוצע בארון הזרימה הלמינרית כדי לשמור על תנאים אספטיים.

1. עכברי מעבדה ביתיים (בני 8 שבועות, נקבת Balb/c) בתנאים ספציפיים נטולי פתוגנים. לספק כדורי מזון ומים ad libitum.
2. יישבו את בעלי החיים בסביבה החדשה למשך שבוע לפני תחילת הניסוי.
3. לפני תחילת הניסוי, לשקול ולהעריך את טמפרטורת הגוף שלהם.
   הערה: נקבת העכברים Balb/c בת שמונה שבועות שוקלת בממוצע כ-19 גרם. הטמפרטורה הממוצעת של עכברי מעבדה נע פיזיולוגית בין 36-38 מעלות צלזיוס.
4. לשפשף את בעל החיים מהצוואר, לנקות את אזור הבטן עם אתנול 70%, ולהזריק i.p. ברזל דקסטרן (מומס ב 1% פוספט מלוחים חיץ 250 מ"ג / ק"ג) ברביע הימני התחתון של הבטן murine באמצעות מחט 25 G 0.5 מ"מ x 16 מ"מ, כ 2-3 שעות לפני הזיהום.
   הערה: ההזרקה התוך צפקית בוצעה ברביע הימני התחתון של הבטן כדי למנוע פגיעה באיברי הבטן כגון שלפוחית השתן, הצקום וכו'. מתן מקור ברזל אקסוגני, בצורה של ברזל דקסטרן, לבעלי חיים לפני הזיהום מעדיף הכפלה חיידקית בפונדקאי.
5. לאחר 2-3 שעות, לבצע הרדמה בעלי חיים עם קטמין (50 מ"ג / ק"ג) ו xylazine (3 מ"ג / ק"ג), וחומר סיכה אופתלמי.
6. בדוק את עומק ההרדמה על ידי הבטחת היעדר תגובת כאב בעת צביטת הבוהן.
7. מקם את העכבר בדקוביטוס עצם החזה ומתח בזהירות את הגפיים ואת עמוד השדרה הצווארי כדי לשמור על עמוד השדרה במצב ישר.
8. ערבבו בעדינות את המתלה החיידקי כדי לשמור על תרחיף עקבי לפני טעינת מזרק של 30 גרם מחט x 8 מ"מ.
   הערה: להכין את ההשעיה החיידקית קרוב ככל האפשר לזמן ההזרקה; בינתיים, לאחסן אותו בטמפרטורת החדר.
9. בהתבסס על הטיטר החיידקי שלאחר ההפשרה (CFU/mL), המשך בחישוב של סך CFU שיש להשתמש בו, ביחס למספר הכולל של בעלי חיים שיידבקו (מינון חיידקי CFU למספר בעלי חיים). המשך בחישוב הנפח המדויק שיש לקחת מהבקבוקון כדי לקבל את סך CFU על ידי החלת פרופורציה בין הטיטר החיידקי לאחר הפשרה (CFU/mL) לבין סך CFU שימושי עבור זיהום של n עכברים (טיטר חיידקי לאחר הפשרה CFU: ml = סה"כ CFU: x). קבע את הכרך הסופי ביחס למספר הכולל של בעלי חיים נגועים.
   הערה: בניסויים אלה נעשה שימוש במגוון רחב של טיטרים מ-10⁴ עד 10⁹ לכל חיה.
10. נקו את אזור הניתוח עם 70% אתנול.
11. זהה את נקודת ההזרקה בעזרת מחט והזריק את CFU המבוסס של מנינגוקוק (זן פראי וזן מוטנטי איזוגני), או מרק GC בתוספת ברזל דקסטרן (5 מ"ג / ק"ג) כביקורת, בנפח כולל של 10 μL לתוך cisterna magna של עכברים דרך חור בור העורפי באמצעות מחט 30 G x 8 מ"מ.
    1. בצע את החיסון cisternal על ידי הצבת המחט בצומת craniocervical , במיוחד בחלל subarachnoid גבי. Ventroflex את הראש כדי להפוך את החלל הזה נגיש.
    2. בקצרה, הניחו את בעל החיים בשכיבה לרוחב, החזיקו את האוזניים מהדרך וכופפו את הצוואר במתינות (90 עד 100 מעלות). ודא כי קו האמצע של הצוואר והראש (מן האף אל occiput) נמצאים במצב מקביל לחלוטין לשולחן.
    3. געו בכנפי האטלס וודאו שהן חופפות, תוך ביטול סיבוב צירים. בדרך כלל ניתן לגעת בשקע טבעי בקו האמצע, שם סביר להניח שהמחט תיכנס לחור העורפי.
    4. השליכו את המזרק והמחט בבטחה לאחר הזרקת עכברים עם Neisseria.
12. הכניסו את בעל החיים לכלוב והמתינו להתעוררות ולהתאוששות מלאה של התנועה.
13. שמור את הכלובים עם עכברים נגועים מתחת לארון זרימה למינרית.
14. עקוב אחר עכברים, 24 שעות לאחר ההדבקה, לסימנים קליניים של תרדמת על פי סולם התרדמת. סולם תרדמת: 1 = תרדמת, 2 = אינו עומד זקוף לאחר סיבוב על הגב, 3 = עומד זקוף תוך 30 שניות, 4 = עומד זקוף תוך 5 שניות, פעילות אמבולטורית מינימלית, 5 = נורמלי.
    הערה: כאשר בבעלי חיים נרשם כאב, שיכוך כאבים עם meloxicam (5 מ"ג / ק"ג i.p. למשך המחקר) ניתנה.

2. הישרדות בעלי חיים וספירות CFU

1. הישרדות בעלי חיים
   1. הכינו חיסון חיידקי במינונים שונים (החל מ-10,⁴ עד 10,⁹ CFU לעכבר) כדי להדביק בעלי חיים במסלול i.cist.
   2. חסן עכברי ביקורת עם מרק GC, בתוספת ברזל דקסטרן (5 מ"ג / ק"ג), באותו אופן.
   3. עקוב אחר בעלי חיים עבור תסמינים קליניים: פרווה פרועה, מראה כפוף, היפותרמיה, ירידה במשקל, עייפות, או מוות כל יום לאורך כל הניסוי במשך 168 שעות (7 ימים) לפחות פעמיים ביום במשך כל הניסוי.
   4. מדוד את משקל הגוף והטמפרטורה באמצעות איזון דיגיטלי ומדחום רקטלי, בהתאמה מדי יום.
   5. תעד את הישרדותם של עכברים במשך שבוע.
      הערה: תעד את המוות הטבעי של בעל החיים לאחר ההדבקה בזמן שבעלי החיים שמגיעים לערך תרדמת של 2 או ששורדים מעל 168 שעות של תצפית יעברו המתת חסד.
   6. מרדימים עכברים עם ערך תרדמת של 2 או ששורדים לאורך זמן ההשגחה עם קטמין (50 מ"ג / ק"ג) וקסילזין (3 מ"ג / ק"ג) ולהחיל משחה אופתלמית.
   7. בדוק שתגובת הכאב נעדרת על ידי צביטת בוהן.
   8. לבצע המתת חסד של עכברים על ידי נקע צוואר הרחם ולרשום אותם כמתים לניתוח סטטיסטי.
   9. המשך להישרדות בעלי החיים או בדיקת ספירת CFU על בעלי החיים הנגועים.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
אזעקה-מדחום	טסטו	9000530	מכשיר
מזרק BD Micro Fine	ב.ד.	320837	אינסולין U-100
מזרק BD פלסטיפק 1 מ"ל 25GA 5/8in	ב.ד.	300014	05x16 מ"מ
מזרק BD פלסטיפק 5 מ"ל	ב.ד.	308062	07 x 30 מ"מ
ארון זרימה למינרי אנכי AURA B של BIOHAZARD	ביו אייר s.c.r.l.	אאורה B3	מכשיר
C150 CO2 אינקובטור	בינדר	9040-0078	מכשיר
תעודת תקן דיאט	Mucedola רח' אינרוסטריאלניה	4RF21	כדורי מזון לבעלי חיים
פינצטה Dumont HP 5 נירוסטה	F.S.T. מאת DUMONT	AGT5034	0.10 x 0.06 מ"מ עצה
איזון אלקטרוני	ג'יברטיני	EU-C1200	מקסימום 1200 גרם, d = 0.01 גרם, T = -1200 גרם
תמיסת דקסטרן ברזל	סיגמא-אולדריץ'	D8517-25ML
קטמין	אינטרווט
ארון בטיחות מיקרוביולוגי BH-EN ו-BHG Class II	מהר	BH-EN 2004
צינורות מיקרוצנטריפוגות 1.5 מ"ל	מותג	PP780751	מכסה בורג PP, grad
מלקחיים לטיפול בעכבר	פ.ס.ט.	11035-20	גומי משונן; משטח אחיזה: 15 x 20 מ"מ
כפפות לטקס טבעיות	מדיקה	M101
Touch N Tuff כפפות ניטריל חד פעמיות	אנסל	92-500
קסילזין	אינטרווט