ניטור דינמיקת גיוס נויטרופילים ועומס חיידקים באתר ההדבקה במודל מורין

תקציר

מקור: Anderson, L. S., et al. מודל עכבר להערכת תגובה חיסונית מולדת לזיהום סטפילוקוקוס זהוב. J. Vis. Exp. (2019).

סרטון זה מדגים הדמיה in vivo כדי לחקור את דינמיקת גיוס הנויטרופילים באתר זיהום בעכבר מהונדס מדוכא חיסון עם נויטרופילים המבטאים GFP. זה כרוך הזרקת חיידקים זוהרים כדי לגרום לזיהום. זה מוביל גיוס נויטרופילים לאתר הזיהום, אשר מעקב נעשה על ידי הדמיה.

פרוטוקול

כל הנהלים הנוגעים למודלים של בעלי חיים נבדקו על ידי הוועדה המוסדית המקומית לטיפול בבעלי חיים ועל ידי ועדת הבדיקה הווטרינרית JoVE.

1. מקור עכבר ודיור

1. להפיק עכברי LysM-eGFP על רקע גנטי C57BL/6J. להפיק LysM-EGFP×MyD88^-/- עכברים על ידי חציית עכברי LysM-EGFP עם עכברי MyD88^-/- על רקע C57BL/6J.
2. עכברי בית בויבריום. עבור מחקרים אלה, בעלי חיים שוכנו באוניברסיטת קליפורניה, דייוויס בקבוצות לפני הניתוח וביחידות לאחר הניתוח. השתמש בעכברים בין הגילאים 10-16 שבועות.

2. הכנה וכימות חיידקים

1. הסר את זן S. aureus הביולומינסנטי המעניין מאחסון של -80 מעלות צלזיוס כדי להפשיר על קרח. פסים על צלחת אגר בדם בקר 5%. לדגור על הצלחת המפוספסת באינקובטור לח ב 37 ° C לילה (16 שעות).
   הערה: בפרוטוקול זה נעשה שימוש בזן SH1000 ALC2906. זן זה מכיל את פלסמיד המעבורת pSK236 עם החלבון קושר הפניצילין 2 מקדמי התמזגו לקלטת הכתב luxABCDE מבית Photohabdus luminescens.
2. הכינו ציר סויה טריפטי (TSB) על ידי ערבוב 0.03 גרם אבקת TSB לכל מ"ל מים טהורים, ואוטוקלאבה TSB לעיקור. כאשר מקורר, להוסיף את כל אנטיביוטיקה הכרחית באמצעות טכניקה סטרילית. בפרוטוקול זה, הוסף 10 מיקרוגרם / מ"ל של כלוראמפניקול ל- TSB כדי לבחור לביטוי של פלסמיד המעבורת pSK236, המכיל את קלטת ה- luxABCDE של ביולומינסנציה.
3. בחר 3-4 מושבות נפרדות מצלחת S. aureus לתוך TSB עם 10 מיקרוגרם / מ"ל chloramphenicol כדי להתחיל תרבית לילה. יש לדגור על חיידקים על שייקר דגירה בטמפרטורה של 37°C למשך הלילה (16 שעות).
4. התחל תרבית חיידקים חדשה מתרבית הלילה על ידי דילול דגימה 1:50 לתוך TSB עם 10 מיקרוגרם / מ"ל chloramphenicol. תרבית בשייקר דגירה ב-200 סל"ד וב-37 מעלות צלזיוס.
5. שעתיים לאחר פיצול ה-S. aureus, נטרו את הצפיפות האופטית ב-600 ננומטר (OD₆₀₀) על ספקטרופוטומטר. שימו לב ל-OD₆₀₀ לעומת הזמן כדי למצוא צמיחה בשלב הלוגריתמי האמצעי. עבור זן SH1000 ALC2906, OD₆₀₀ של 0.5 הוא אמצע לוגריתמי ומתאים לריכוז של 1 x 10⁸ CFU/mL (איור 1).
6. כאשר OD₆₀₀ הוא 0.5, שטפו חיידקים ביחס 1:1 עם DPBS קר כקרח. צנטריפוגו את החיידקים למשך 10 דקות בטמפרטורה של 3,000 x גרם ו-4°C. דקרו בזהירות את הסופרנאטנט והוסיפו היטב DPBS ומערבולות מקוררות נוספות. צנטריפוגה פעם נוספת למשך 10 דקות ב 3,000 x גרם ו 4 ° C.
7. בזהירות decant supernatant. השהה מחדש את גלולת החיידקים בריכוז הרצוי. עבור מחקרים אלה, לאסוף 3 מ"ל של ALC2906 SH1000 ולהשהות מחדש ב 1.5 מ"ל של PBS, בקורלציה לריכוז חיידקים של כ 2 x 10⁸ CFU/מ"ל. יש לשמור חיידקים על קרח עד לשימוש.
8. כדי לוודא את ריכוז החיידקים, יש לדלל 100 μL מדגימת החיידקים בקנ"מ 1:10,000 ו-1:100,000 ב-PBS. צלחת 20 μL aliquots על צלחת אגר. דגירה ב 37 מעלות צלזיוס באינקובטור לח במשך 16 שעות. ספירת CFUs על ידי בדיקה גסה וחישוב ריכוז חיידקים למחרת.

3. פצעי עור כריתה וחיסון עם S. aureus

1. יש לתת 100 μL של 0.03 מ"ג/מ"ל buprenorphine hydrochloride (~0.2 מ"ג/ק"ג) לכל עכבר באמצעות הזרקה intraperitoneal.
2. עשרים דקות לאחר ההזרקה, מניחים 2-4 עכברים בתא עם 2-3 חמצן LPM עם 2-4% isoflurane. לאחר הרדמה מלאה של העכברים, העבירו את העכברים אחד בכל פעם לקונוס אף המחובר לחמצן 2-3 LPM עם 2-4% איזופלורן. ודא שהעכברים מורדמים במלואם על ידי צביטה חזקה של כל כפה אחורית בין האגודל לאצבע. המשך לשלב הבא אם החיה אינה מגיבה לצביטה.
3. יש לגלח קטע בגודל 1 אינץ' על 2 אינץ' בגב העכבר בעזרת קוצצים חשמליים ולנקות את האזור מגזירי פרווה באמצעות מגבון נקי או גזה. הימנע משימוש תחליב depilatory כי זה עלול לגרום דלקת עודפת.
4. נקה את גב העכבר תחילה עם 10% גזה ספוגה ביוד פובידון ולאחר מכן עם 70% גזה ספוגה אתנול. נקו את האזור בתבנית ספירלית, תוך תנועה החוצה ממרכז אזור הניתוח. יש להמתין כדקה לייבוש אזור הניתוח לפני הניתוח.
5. החזק את גב העכבר המגולח באופן רופף בין שתי אצבעות ולחץ בחוזקה ביופסיית אגרוף סטרילית בקוטר 6 מ"מ במרכז אזור הניתוח המוכן. אין למשוך את העור מתוח.
   1. סובבו את ביופסיית הניקוב כדי ליצור מתאר עגול על העור שחותך את העור במלואו לפחות בחלק אחד של המתאר. היזהרו לא לחתוך לתוך הפאשיה או הרקמה שמתחתיה.
   2. השתמש במספריים סטריליים ומלקחיים כדי לחתוך דרך האפידרמיס והדרמיס בעקבות התבנית המעגלית המוטבעת על ידי ביופסיית הניקוב.

4. חיסון S. aureus

1. מלאו מזרק אינסולין 28 גרם בחיסון החיידקי הרצוי. במחקר זה, יש לתת ריכוז של 1 x 10⁸ CFU/mL (50 μL). אין לתת יותר מ-100 מיקרוליטר נפח.
2. יש להזריק 50 מיקרוליטר של חומר חיסון בין הפאשיה לרקמה במרכז הפצע על גב העכבר. ודאו שהחיסון יוצר בועה במרכז הפצע עם מינימום דליפה או פיזור.
   1. משכו את הדרמיס הצידה, החזיקו את המזרק כמעט במקביל לרקמה, ולאט לאט דחפו את המזרק לתוך הרקמה עד שתורגש ירידה פתאומית בהתנגדות, המעידה על פירסינג של הפאשיה. בזהירות להוביל את המזרק למרכז הפצע ולהוציא את החיסון לאט. מוציאים את המזרק לאט מהחיה.
3. הזריקו את אותו נפח של PBS סטרילי לפצעים של בעלי חיים לא נגועים כמתואר לעיל.
4. להחזיר את החיה לכלוב שלה. הניחו את הכלוב מתחת למנורת חום או על גבי כרית חימום, והשגיחו על בעל החיים עד להחלמה מההרדמה.

5. ב- Vivo BLI ו- FLI

1. אתחל את כל צלם החיות באמצעות תוכנת המכשיר. מרדימים עכברים בתא המקבל 2-3 חמצן LPM עם 2-4% איזופלורן. יש להזרים חומר הרדמה לקונוסים שבתוך מכשיר ההדמיה.
2. הכניסו את העכבר הפצוע והנגוע למכונת הצילום. מקם את העכבר כך שהפצע יהיה שטוח ככל האפשר. השתמש בהגדרת הרצף הבאה כדי לצלם את העכברים.
   1. בחרו Luminescence and Photograph כמצב ההדמיה. זמן החשיפה הוא דקה אחת בבינינג קטן ו-F/stop 1 (הארה) ו-F/stop 8 (צילום). מסנן הפליטה פתוח. לחץ על לרכוש כפתור להקלטת התמונה.
   2. בחרו 'פלואורסצנטיות ותצלום' כמצב ההדמיה. זמן החשיפה הוא 1 s בבינינג קטן ו-F/stop 1 (פלואורסצנציה) ו-F/stop 8 (צילום) עם אורך גל עירור של 465/30 ננומטר ואורך גל פליטה של 520/20 ננומטר עם עוצמת מנורה גבוהה. לחץ על לרכוש כפתור להקלטת התמונה.
3. החזירו את בעל החיים לכלוב שלו והשגיחו עליו עד להחלמה מההרדמה.
4. דמיינו עכברים מדי יום כמתואר לעיל.

6. ניתוח תמונות

1. פתח תמונות לכימות.
2. מקם אזור עגול גדול של עניין (ROI) על כל אזור הפצע, כולל העור שמסביב לכל עכבר בתמונה. אותות הנויטרופילים in vivo FLI EGFP ואותות in vivo BLI S. aureus נמשכים מעבר לקצה הפצע לאחר מספר ימים ונכללו במחקרים אלה (איורים 2A ו-2B). לחץ על מדוד החזר השקעה ורשום ערכים עבור שטף ממוצע עבור כל עכבר. התווה את השטף הממוצע של כל אות (p/s) לעומת זמן.
3. אם רוצים מספרים מוחלטים של נויטרופילים או S. aureus בפצע, בצע את הניסויים הבאים.
   1. כדי להתאים את מספרי הנויטרופילים לאותות ה-in vivo FLI EGFP, פצעו עכברי C57BL/6J כמתואר לעיל, והעבירו מגוון של נויטרופילים שמקורם במח עצם (5 x 10⁵ עד 1 x 10⁷) מתורמים LysM-EGFP או LysM-EGFPxMyD88^-/- ישירות על גבי פצעים שונים. התמונה כפי שתוארה לעיל ולהתאים את אותות ה-in vivo FLI EGFP לכמות הידועה של נויטרופילים.
   2. כדי להתאים את S. aureus CFU לאותות in vivo BLI, פצע והדביק עכברים כמתואר לעיל. ביום הראשון לאחר ההדבקה נרשם in vivo BLI מאותת מהעכברים ומיד מרדימים ומצננים פגרים. מוציאים את הבלו, עושים הומוגניזציה לרקמה, ומדללים את החיידקים על האגר לדגירת לילה. למחרת, ספרו מושבות כדי לקבוע CFU לכל פצע.
4. כדי למדוד ריפוי פצעים, התאימו החזר השקעה מעגלי על קצה הפצע ומדדו את שטח הפצע (ס"מ²) והתוו את השינוי החלקי מקו הבסיס לעומת הזמן (איור 2C).

תוצאות

איור 1: מתאם בין ספירת OD₆₀₀ ו-CFU עבור מושבות ALC2906 3-4 ALC2906-SH1000 נקטפו מצלחת אגר והועברו ל-TSB עם כלוראמפניקול של 10 מיקרוגרם/מ"ל לתרבית לילה. למחרת, המתלה פוצל 1:50 ל-TSB עם כלוראמפניקול 10 מיקרוגרם/מ"ל ותורבת. צפיפות אופטית של 600 ננומטר (OD₆₀₀) נמדדה במרווחי זמן קבועים לאחר שעתיים באמצעות ספקטרופוטומטר. בכל מדידה, החיידקים דוללו בקנ"מ 1:100,000 ב-PBS קר כקרח והועלו על צלחת אגר לצורך דגירה למשך הלילה...

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
14 מ"ל פוליפרופילן צינור תחתון עגול	בז	352059
ניקוב ביופסיה חד פעמי 6 מ"מ	אינטגרה מילטקס	33-36
ביולומינסנט S. aureus	לויד מילר, ג'ונס הופקינס	ALC 2906 SH1000
אגר דם בקר, 5%, הארדי דיאגנוסטיקה	VWR	10118-938
Buprenoprhine hydrochloride הזרקה	אספקה רפואית מערבית	7292	0.3 מ"ג/מ"ל
עכברי C57BL/6J	ג'קסון לברטורי	664
כלוראמפניקול (אבקה גבישית)	פישר ביוריאגנטים	BP904-100
DPBS (1X)	גיבקו	14190-144
מזרקי אינסולין	בקטון, דיקסון ושות'	329461	0.35 מ"מ (28 גרם) x 12.7 מ"מ (1/2 אינץ')
מערכת הדמיה IVIS Spectrum In Vivo	פרקין אלמר	124262
תוכנת Living Image – סדרת IVIS Spectrum	פרקין אלמר	128113
עכברי LysM-eGFP	תומאס גראף אלברט איינשטיין קולג' בניו יורק	נה
ספקטרופוטומטר מיקרו-נפח	תרמופישר סיינטיפיק	ND-2000
עכברי KO MYD88	ג'קסון לברטורי	9088
ספוגים לא ארוגים	AMD- Ritmed Inc	A2101-CH	5X5 ס"מ
פובידון יוד 10% תמיסה	אפליקר	697731
מרק סויה טריפטי	בקטון, דיקסון ושות'	211825