$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
כל הנהלים הנוגעים למודלים של בעלי חיים נבדקו על ידי הוועדה המוסדית המקומית לטיפול בבעלי חיים ועל ידי ועדת הבדיקה הווטרינרית JoVE.
1. מקרופאגים מח עצם גזירה והפעלה עם נוגדנים
- בצע המתת חסד באמצעות חנק CO2.
- מקם את העכבר בתא האינדוקציה. הרדימו את העכבר בהרדמה איזופלורנית 5%, למשך 60 - 90 שניות, עד לחוסר תנועה והנשימה עמוקה ואיטית.
- כבה את ההרדמה isoflurane ולתת 6 - 8 L / min של CO2 עד העכבר מפסיק לנשום. השאר את העכבר עם CO2 דולק למשך 5 דקות נוספות לפחות. ודא שאין עוד דופק או נשימה. בצע נקע צוואר הרחם כדי להבטיח מוות.
הערה: עכברים בני 8 - 12 שבועות מספקים את התפוקה הגבוהה ביותר של מקרופאגים.
- רססו רגלי עכבר עם 70% אתנול והצמידו אותן בידיים וברגליים מתוחות במצב שכיבה מעל לוח קצף. בעזרת מספריים ומלקחיים לאחיזת העור, בצעו חתך רדוד (0.2 ס"מ) כדי להסיר את העור והפרווה מפני השטח של כל אחת מהרגליים האחוריות.
הערה: בצע הליך זה ואת כל מניפולציות תרבית הרקמה בברדס סטרילי.
- חתוך שרירים כדי להפוך את tibias ואת עצם הירך גלוי. הסר את הטיביאס ועצם הירך, על ידי חיתוך העצם והשרירים ממש מתחת למפרק הירך ומעל הקרסוליים. חתכו כמה שיותר שרירים
.
- רססו עצמות עם 70% אתנול והמתינו דקה עד שהן יתאדו, ואז הניחו אותן בצלחת של 6 בארות של מדיום סומק עצם (מדיום Dulbecco של Iscove (IMDM), 10% סרום בקר עוברי (FBS)).
- חותכים את קצות העצמות על ידי חיתוך 0.1 ס"מ של עצם מהקרסול והחלק העליון של עצם הירך כך שחלל העצם חשוף. ודא כי המוח גלוי ומחט 26 מד ניתן להציב בחלל העצם.
- חתכו את העצמות והשרירים כדי להפריד את הטיביאס ועצם הירך ממפרקי הברך. הכנס מחט 26 מד המחוברת מזרק 10 מ"ל לתוך החלל. לשטוף את מח העצם לתוך צינור חרוטי 50 מ"ל עם 5 מ"ל של מדיום סומק עצם. שטפו שתי טיביות ושתי עצמות הירך, מעכבר אחד, לכל צינור של 50 מ"ל.
- פיפטה מעלה ומטה מספר פעמים או מערבלת את המח במהירות איטית כדי לפזר בעדינות גושים. מחרוזות של מח צריך להיות שבור קטן (פחות מ 0.5 מ"מ) flecks של מח. ממלאים את הצינור החרוטי עד 50 מ"ל עם מדיום סומק העצם. תכולת פיפטה של הצינור החרוטי לתוך בקבוק 75 ס"מ2 רקמה שטופלה בתרבית, ולדגור ב 37 ° C, 5% CO2 עבור 1 h.
הערה: מקרופאגים בוגרים ותאים מזנכימליים יידבקו בבקבוק ויושלכו, בעוד האבות ההמטופויטיים הרצויים יישארו בהשעיה.
- פיפטה המדיום עם אבות hematopoietic לתוך צינור חרוטי 50 מ"ל. צנטריפוגה את הצינור ב 300 x גרם בטמפרטורת החדר במשך 5 דקות. יש להשליך את הסופרנאטנט ולהשהות מחדש את הגלולה ב-5 מ"ל של מדיום תרבית גורם מגרה מושבת מקרופאגים (MCSF) (IMDM, 10% FBS, 5 ננוגרם/מ"ל MCSF, 100 U/מ"ל פניצילין/סטרפטומיצין ו-150 מיקרומטר מונותיוגליצרול (MTG)).
- ספירת תאים באמצעות המוציטומטר. הוסף מדיום כדי להשהות תאים לריכוז של 0.5 x 106 תאים / מ"ל, 1.5 x 107 תאים / בקבוק ב 30 מ"ל של בינוני פיפטה למעלה ולמטה בעדינות. פיפטה 30 מ"ל של תרחיף לתוך 75 ס"מ חדש 2 רקמה תרבית צלוחיות מטופלות.
- ביום 4 וביום 7 לאחר התרבית הראשונית בשלב 1.9, יש לוודא שהתאים דבקים ומסועפים מעט באמצעות מיקרוסקופ שדה בהיר עם ניגודיות פאזה הפוכה. השליכו את התווך המכיל את התאים שאינם דבקים. לשטוף את התאים עם IMDM פעם אחת ולהוסיף 30 מ"ל של מדיום תרבית MCSF.
- כאשר התאים בשלים עד היום ה-10 (>95% חיוביים עבור F4/80 ו-Mac-1), ודא שוב שהתאים נצמדים ובמידה מועטה.
- כדי לצלחת תאים לגירוי, הסר את מדיום התרבית מהבקבוק והוסף 8 מ"ל של מאגר דיסוציאציה תאי מבוסס EDTA ללא אנזימים (טבלה של חומרים). לדגור על התאים במשך 5 דקות ב 37 ° C, 5% CO2.
- מגרדים תאים בעדינות, עם כמות קטנה של לחץ, באמצעות מגרד תאים סטרילי. בדקו במיקרוסקופ שהתאים התנתקו משטח הבקבוק. פיפטה ניתקה תאים לתוך צינור חרוטי 50 מ"ל. שטפו את הבקבוק 3 פעמים עם 5 מ"ל של IMDM ואגרו את תמיסת השטיפה עם התאים שנקטפו. תאי צנטריפוגה ב 300 x גרם בטמפרטורת החדר במשך 5 דקות.
- להשהות מחדש את גלולת התא ב 3 מ"ל של מדיום תרבית MCSF לכל 50 מ"ל צינור חרוט. ספירת תאים קיימא באמצעות המוציטומטר. תאי השעיה בריכוז של 1 x 106 תאים/מ"ל וצלחת 100 μL של תרחיף תאים (1 x 105 תאים/באר) לכל באר של תרבית רקמה 96 באר מטופלת, צלחת תחתונה שטוחה.
הערה: עצמות מעכבר אחד ייצרו מספיק תאים ל-100 בארות. אם תרצה, 1 מ"ל של תאים יכול להיות מצופה צלחת 6 באר (תרבית רקמה מטופלת, תחתית שטוחה). מספר גדול יותר של תאים (1 x 10,6 תאים) עשוי להיות שימושי עבור ניתוחי כתמים מערביים.
- לאחר ההדבקה, לעורר בארות כפולות או משולשות כל אחת עם 10 ng/mL של LPS ב- IMDM, 30 מ"ג / מ"ל של IVIg, או IVIg + LPS. מינונים של LPS או IVIg יכולים להיות טיטרציה כדי לייעל את התגובות. השאר בארות כפולות או משולשות כפקדים לא מגורים. לדגור אותם במשך 24 שעות (37 ° C, 5% CO2).
הערה: תאים מצופים מחדש צריכים להיצמד לבארות תרבית רקמה תוך שעה אחת.
- אספו סופרנאטנטים של תאים מכל באר לתוך צינורות מיקרוצנטריפוגות בודדות של 1.7 מ"ל והסירו כל חומר חלקיקי על ידי סיבוב במהירות של 10,000 x גרם למשך 5 דקות.
- הסר את התא supernatant ולמנוע להפריע את הכדור. מניחים את הסופרנאטנט התא המזוקק בצינור מיקרוצנטריפוגה סטרילי.
הערה: ניתן לבדוק סופרנאטנטים של תאים עבור ציטוקינים, IL-10 ותת-יחידה של ציטוקינים, IL-12/23p40, על ידי בדיקת אימונוסורבנט מקושרת אנזימים (ELISA) באופן מיידי או לאחסן בטמפרטורה של -80 מעלות צלזיוס לטווח ארוך. פעל בהתאם לפרוטוקול ELISA מתוך ערכה זמינה מסחרית (Table of Materials). ציטוקינים מעודדי דלקת אחרים ניתנים לבדיקה, כגון IL-6 ו- TNF, מכיוון שהם מופחתים גם על ידי טיפול משותף עם גירוי IVIg + LPS בהשוואה לגירוי עם LPS בלבד. לאחר הגירוי, ניתן להכין תאים דבקים לטכניקות כגון כתם מערבי או תגובת שרשרת כמותית של פולימראז (Q-PCR).